川芎嗪对犬CABG后LAD平滑肌细胞表达Ⅷ胶原和p53的影响

　　作者：何维来,周汝元,陈如坤　　作者单位：1安徽医科大学第一附属医院心脏外科， 安徽 合肥 230032， 2浙江大学医学院附属第二医院心胸外科，浙江 杭州 310009

　　【摘要】目的：探讨川芎嗪(LG)对冠状动脉旁路移植术(CABG)后冠脉左前降支(LAD)血管平滑肌细胞表达VIII型胶原和p53反应性改变的影响. 方法：45只健康杂交犬体质量(17.9±2.2) kg，结扎LAD近段制作局部冠状动脉狭窄模型后，将存活的28只犬分为LG组(n=10)，维拉帕米(VR)组(n=10)和生理盐水(CN)对照组(n=8)，三组均行CABG，手术前后对各组犬施加不同的药物干预. 经犬右心耳抽血检测不同时段血浆NO含量变化;术后2 wk切取局部LAD， 用Western Blot法检测LAD组织匀浆VIII型胶原和p53蛋白表达，并用免疫组化方法观察两种分子在局部的原位表达情况. 结果：吻合血管后血浆NO含量60 min时，LG组下降至(77.7±2.4) μmol/L，VR组为(69.3±1.5) μmol/L，CN对照组为(62.4±2.1) μmol/L，LG组与其他两组相比较差异具有统计学意义(P<0.05);三组正常LAD的组织匀浆表达VIII 型胶原和p53水平低，VR组和CN对照组的血管吻合处远段LAD表达VIII 型胶原增加比川芎嗪组明显，而LG组p53表达增加比其他两组明显. 免疫组化方法检测表明：三组的吻合处远段血管片段局部VIII 型胶原表达明显增加，LG组明显弱于其他两组，LG组可以检测到p53表达，而其他两组吻合后损伤血管的p53无明显表达. 结论：LG可抑制CABG后血管内皮损伤及LAD平滑肌细胞表达VIII胶原反应性的上调和促进p53表达，表明其可能具有防治CABG术后再狭窄的作用.

　　【关键词】 冠状动脉狭窄;血管平滑肌细胞;川芎嗪;VIII型胶原;p53;基因表达

　　基金项目：安徽省十五攻关课题(G321009)

　　Intervention of ligustrazine on expressions of VIII collagen and p53 in vascular smooth muscle cells of canine LAD after CABG in dogs

　　HE WeiLai, ZHOU RuYuan, CHEN RuKun

　　1Department of Cardiovascular Surgery, First Affiliated Hospital, Anhui Medical University, Hefei 230032, China,

　　2Department of Cardiothoracic Surgery, Second Affiliated Hospital, Medical School, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China

　　【Abstract】 AIM: To explore the interventional effect of ligustrazine on the expressions of type VIII collagen and p53 by vascular smooth muscle cells (VSMCs) of canine left anterior descending artery (LAD) after coronary artery bypass graft (CABG). METHODS: Fortyfive healthy mongrel dogs weighing (17.9±2.2) kg were ligated at the near part of the LAD to make local coronary artery stenosis models. The 28 surviving dogs were divided into 3 groups: ligustrazine group (n=10), verapamil group (n=10) and control group (n=8), and all animals underwent CABG surgeries. The 3 groups were given different drug intervention. We measured the changes of plasm NO of blood samples collected from right atrial appendage in different time. Local LAD harvested 2 wk after surgery were detected for the expressions of type VIII collagen and p53 in VSMCs by Western Blotting and immunohistochemistry methods. RESULTS: The content of NO of the 3 groups continually changed with time elapsing after anastomosis. Compared with the content of NO of ligustrazine group descending to (77.7±2.4) μmol/L in 60 min, the descent of measurement of the other 2 groups [(69.3±1.5) μmol/L in verapamil group, (62.4±2.1) μmol/L in control group] was significant (P<0.05). Expressions of type VIII collagen and p53 in nomal LAD tissue homogenate by Western Blotting were lower, but after anastomosis, the expression of type VIII collagen in LAD distant from anastomosis site in verapamil group and control group was higher than that of ligustrazine group, while the expression of p53 in ligustrazine group was obviously upregulated compared with the other 2 groups. The results by immunohistochemistry methods indicated that the expression of type VIII collagen in local impaired LAD tissiue in the 3 groups was obviously upregulated, and ligustrazine group was lower than the other 2 groups. The expression of p53 could be detected conspicuously in ligustrazine group，but it was not found in the other 2 groups. CONCLUSION: Ligustrazine can effectively restrain the injury of CABG on vessel endothelium, and inhibit the reactive upregulation of type VIII collagen of canine impaired LAD, and upregulate the expression of p53 after CABG. Thus ligustrazine may prevent the restenosis of coronary artery after CABG.

　　【Keywords】 artery coronary stenosis; vascular smooth muscle cell; ligustrazine, VIII type collagen; p53; gene expression

　　0引言

　　冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass graft, CABG)已被广泛认为是治疗有症状性冠脉疾病的有效方法[1]，但血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常迁移、增殖和细胞外基质过多沉积可导致术后血管结构再塑改变，是引起再狭窄的两个重要因素[2]. CABG侵入性操作损伤内皮时，由于内皮表达紊乱，NO表达含量下降可诱导VSMCs表型调变 [3-4]. 对于如何有效调控冠状动脉损伤后内皮细胞和VSMCs表达变化，抑制CABG后再狭窄，目前尚无有效的方法，但有研究[5-6]表明，川芎嗪(ligustrazine, LG)具有有效的内皮保护和调节微循环作用. 本研究我们试图通过分析LG对CABG后VSMCs表达VIII 型胶原和p53反应性改变的影响，探讨其对CABG后再狭窄的防治作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　成年健康杂种犬(2 a以上)45只，体质量(17.9±2.2) kg(安徽医科大学实验动物中心). LG，批号：971102，纯度：99% (无锡第七制药有限公司);维拉帕米(verapamil，VR)，批号：020701(上海禾丰制药有限公司);硝酸还原酶法间接测定NO试剂盒(北京北免东雅生物技术研究所);硝化纤维膜(美国Amersham公司);兔抗 p53 mAb(1∶20，美国Calbiochem公司);固化聚偏乙烯氟化物膜(德国Eschbach公司); 生物荧光素结合羊抗几内亚猪 IgG(美国Vector实验室);鼠抗人 p53 mAb (14211A, 美国Pharmingen公司);SDS聚丙酰胺凝胶电泳、鼠抗人 VIII 型胶原mAb (clone 6A2)、抗天然牛 VIII 型胶原多克隆抗血清、羊抗兔抗体和辣根过氧化物酶等(美国Sigma公司);CYAM32型麻醉呼吸机(上海医疗设备厂);ACUSON128XP/10血管外超声(美国ACUSON公司).

　　1.2方法

　　1.2.1局部冠脉狭窄模型制作首次用戊巴比妥钠(30 mg/kg)静注麻醉犬，行气管插管后，予机械通气，给予室内空气混合氧及氟烷，气体浓度为(1.2±0.2)vol%. 经左第四肋间小切口，将血管外超声的消毒探头[频率为 (2.5～4.0) MHz ]直接置于备结扎的冠脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)远段心脏表面，在直接测量血流量的指导下，于距发出处0.5 cm处用50的prolene线结扎LAD近端阻断血流的75%.

　　1.2.2CABG和药物干预将结扎LAD后所有存活犬28只，随机分为三组： LG组(n=10只)、VR组(n=10只)和生理盐水(control，CN)对照组(n=8只). 三组犬均采用高脂饲料(饲料配方：1.5%胆固醇，17.5%酪蛋白，14%猪油，6%的花生油，热量保证2400千卡/d)喂养至结扎2 mo后施行CABG，经左侧第四肋间切口游离左侧胸廓内动脉，将其远端吻合于LAD结扎处远段，并对三组犬施加不同的干预. LG组：术前3 d和术后3 d经外周连续静注LG溶液10 mg/(kg•d)，术中吻合血管前20 min 静注LG溶液10 mg/kg，用LG溶液(800 mg/L)冲洗左胸廓内动脉及LAD备吻合处局部;VR组于同时间段静注VR溶液0.5 mg/(kg•d)，并用VR溶液40 mg/L作局部冲洗;CN对照组用同量的CN进行静注和局部冲洗.

　　1.2.3血浆NO含量变化检测于CABG术中吻合血管前及后5，15，30，45和60 min不同时段分别经犬右心耳抽血，按硝酸还原酶法间接检测试剂盒说明操作方法进行血浆NO含量测定.

　　1.2.4Western Blot检测CABG 2 wk处死存活犬，切取血管吻合处前和吻合处远段的LAD组织，立即置于液氮罐中备检. 检测前于冰点下用蛋白提取系统提取血管组织匀浆，缓冲剂 (脲9 mmol/L，屈立通X100 3 mmol/L和2巯基乙醇0.64 mmol/L)处理. 样本包含100 μg蛋白置于200 g/L SDS聚丙酰胺凝胶电泳， 用SDSPAGE分析蛋白，转到硝化纤维膜上和兔抗 p53 mAb在4℃共孵育过夜，羊抗兔抗体和辣根过氧化物酶共扼作为二抗. 最后，冲洗印迹并与电化学荧光基片浸染，用增强化学荧光敏感电偶设备照相机检测特定主要抗体免疫反应.

　　300 g/L SDS聚丙酰胺凝胶每格取100 μg蛋白匀浆样品分析VIII 型胶原，凝胶电泳后用半干电印记设备电镀于固定聚偏乙烯氟化物膜上. 分子量标记用考马斯亮蓝免疫染色，硝酸纤维过滤膜用干奶在TBST中封闭2 h，与鼠抗人 VIII 型胶原mAb孵育1 h，用PBSTween冲洗，与羊抗鼠抗体和辣根过氧化物酶共扼作为二抗，同样用荧光照相检测特定主要抗体免疫反应.

　　1.2.5免疫组化取出冷冻的血管组织，切成 5 μm切片，用40 g/L多聚甲醛溶液固定后，自动系统进行石蜡包埋，用高压锅在(10 mmol枸橼酸中，pH 6)加热，并用蛋白激酶部分酶切法处理5 min，进行免疫染色抗原修复. 5 μm动脉片段与抗天然牛 VIII 型胶原多克隆抗血清(1∶400稀释)一起孵育，1∶1000 稀释二抗(生物荧光素结合羊抗几内亚猪IgG)结合， 用卵白素生物素辣根过氧化物酶方法，3,3′二氨基联苯胺作为染色剂进行染色，阳性染色表现为棕褐色，淡蓝色为阴性.

　　用单克隆鼠抗人p53抗体检测p53原位表达. 切片经抗原处理后与抗人p53抗体共孵育作为阳性染色对照，阴性对照实验用相应免疫前鼠血清替代主要抗体. 超氧化反应由3氨基9乙基咔唑产生红棕色的反应产物，核由苏木素轻度反染. 用ABC方法p53积累表达及中层细胞共表达的双重标记辩明. 超氧化反应由AEC 或3氨基9乙基咔唑产生红棕色或暗棕色的染色反应产物，用萘酚ASMX磷酸盐和坚牢蓝BB盐或坚牢蓝TR盐产生碱性磷酸酶反应. 光学显微镜下观察呈明显的暗棕色表明p53抗原存在. 以人肺癌组织作为染色的阳性对照.

　　统计学处理：血浆样品NO测量结果以x±s表示，应用SAS 8.2软件包，采用重复测量设计的方差分析进行组间差异检验， P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1血浆NO含量变化吻合血管后不同时段LG组血浆NO含量下降受到抑制，各组间血浆NO检测含量随时间变化组间差异具有统计学意义(P<0.05, 表1).表1吻合血管前后三组不同时段血浆NO含量变化(略)

　　2.2LAD组织匀浆VIII胶原及p53表达三组正常LAD组织匀浆的VIII型胶原的PCR 产物表现为低表达，而三组血管吻合处远段血管组织VIII型胶原的表达明显增加， VR组和CN对照组VIII型胶原表达增加明显高于LG组(图1). 三组血管吻合处前正常血管p53表达水平低，VR组和CN对照组吻合后的损伤血管组织p53的表达没有明显变化，而LG组吻合处后血管组织匀浆的p53表达有显著的增加(图2).

　　2.3LAD血管VIII型胶原及p53原位表达血管吻合前LAD血管的VIII型胶原表达极低，血管吻合后吻合处远段LAD血管片段的VIII型胶原特殊染色显示，局部VIII型胶原表达明显增加， VR组和CN对照组的表达显著强于LG组， VIII型胶原表达在靠近血管腔的中层较明显，在内弹力膜(箭头所示)附近的细胞间表达增高特别显著(图3)，提示VSMCs大规模的从中膜向内膜迁移前在中层进行增殖. 免疫组化检测结果显示：正常的LAD血管和血管吻合后CN对照组和VR组吻合处远段损伤血管几乎不能检测出p53表达， LG组可以检测到p53表达明显增加(图4).

　　3讨论

　　CABG侵入性操作损伤冠状动脉内皮后，由于多A：正常的冠状动脉;B：川芎嗪组损伤动脉;C：维拉帕米组损伤动脉;D：生理盐水组损伤动脉. 红棕色表示免疫反应阳性，箭头指向内弹力膜.

　　种生长因子被异常激活，刺激VSMCs发生表型调变和进入细胞增殖周期，是引起术后血管内膜增厚和粥样硬化等再狭窄病变发生的重要因素之一 [7-8]. CABG手术前后应用LG，可以显著增加损伤后内皮细胞对NO的表达，表明其可以抑制CABG侵入性操作及缺血再灌注对冠脉和血管桥内皮结构和功能的损伤. 可能的原因是LG通过阻止细胞外过多的Ca2+通过钙通道进入细胞内，以促进内皮细胞上皮钠通道蛋白的表达[9]. 细胞外基质环境中的胶原表达模式对VSMCs黏附和迁移、增殖等基本活动有重要调节作用[10]. 表达VIII型胶原阳性的VSMCs分布于从血管内膜到中膜区域，表明其不仅是这两层结构的血管基质成分，而且通过其与VSMCs基膜和周围基质的接触作用，对VSMCs表型和细胞活动起着重要的调节作用[11]. 我们采用多克隆抗天然牛VIII型胶原血清进行免疫组化试验，检测损伤动脉中VIII 胶原蛋白的原位表达情况. 结果显示，LG可能通过抑制内皮损伤，抑制整合素受体表达改变并使基质金属蛋白酶表达下调，抑制生长因子激活诱导的反应性VIII 胶原表达增加，影响细胞外基质对VSMCs去分化调变的调节作用，而直接抑制VSMCs迁移[12]. LG促进损伤动脉p53表达上调，表明其对血管损伤后VSMCs的p53基因表型调变的抑制和调节作用，可使损伤后血管VSMCs的凋亡增加，并诱导适度的生长停止，对CABG损伤血管后VSMCs的过度增殖产生抑制作用. LG对损伤后p53的反应性表达改变的调节作用，还提示其可能对损伤后血管VSMCs的多种功能表型调变具有影响.

　　综上所述，LG可通过抑制CABG对内皮细胞的结构和功能损伤及对CABG术后损伤血管局部VSMCs的多种功能表型反应性调变产生影响，可改善微循环血管调节功能，抑制损伤血管的VSMCs异常迁移和增殖，有利于损伤后血管的结构再塑，对防治CABG后再狭窄可能具有一定的作用.

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