大鼠严重胸部创伤肺泡与间质巨噬细胞分泌TNF

　　作者：张伟，蒋耀光，李磊，谢志坚，吕凤林，胡承香　　(第三军医大学大坪医院全军胸心外科中心，重庆 400042;　　第三军医大学大学大坪医院野战外科研究所一室，重庆 400042)

　　摘要： 目的 观察大鼠严重胸部创伤后肺泡(AM)及间质(IM)巨噬细胞两类亚群分泌TNFα、IL6的差异，并探讨其意义。方法 利用小型多功能生物撞击机，以400kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤，建立大鼠严重胸部创伤模型，支气管肺泡灌洗，机械结合酶消化法分离、培养肺泡及间质巨噬细胞，动态检测创伤前、创伤后2、4、8、16、24小时以及复合LPS攻击后肺泡及间质巨噬细胞分泌TNFα、IL6的水平。结果 创伤复合LPS攻击后，AM、IM分泌TNFα、IL6增加，伤后4、8、16小时时相点AM分泌TNFα显著高于IM; 伤后每个时相点IM分泌IL6均显著高于AM。结论 大鼠严重胸部创伤对AM、IM分泌TNFα、IL6具有不同影响，其在创伤后机体免疫功能紊乱的过程中具有不同作用，本研究为创伤性急性肺损伤的发病机制提供了一定的实验及理论依据。

　　关键词： 胸部损伤; 肺泡巨噬细胞; 间质巨噬细胞; TNFα; IL6; 大鼠

　　Effect of severe thoracic trauma combined with endotoxin infection on secretory function of alveolar macrophages and pulmonary interstitial macrophages in rats

　　ZHANG Wei,JIANG Yaoguang,LI lei,et al.

　　(Thoracic and Cardiovascular Surgery Research Center,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)

　　Abstract： Objective To observe the different changes of alveolar macrophages and interstitial macrophages on secretory function. Methods Rat models of severe thoracic trauma were established,alveolar macrophages were collected from bronchoalveolar lavage fluid,mechanic flush and enzymatic digestion,and then separated and cultured. Secretory function of AM and IM were observed dynamically before trauma and 2,4,8,16,24h after trauma and challenged by LPS. Results A stable and reliable severe thoracic trauma model was successfully established with 400kPastrike on the upright chest of rat by a multiplefunction strike apparatus. Severe thoracic trauma and LPS challenged increased TNFα、IL6 secretion both in AM and IM. AM secreted more TNFα than IM at 4,8,16h after trauma,and IM secreted more IL6 than AM at every time point after trauma. Conclusion There effect of severe thoracic trauma on secretion of TNFα、IL6 between AM and IM is different. The present study provides valuable laboratorial and theoretical evidence for the research on ALI complicated with severe thoracic trauma.

　　Key words: thoracic trauma; alveolar macrophages; interstitial　macrophages; TNFα; IL6; rats

　　急性肺损伤(ALI)是严重胸部创伤的主要并发症，由于机体免疫功能紊乱而导致的抵抗力下降引起的肺部感染是其最常见的原因。巨噬细胞是一多功能细胞群体，既有吞噬杀菌的非特异性免疫功能，又可通过分泌细胞因子参与特异性免疫[1]，由此不难看出，在创伤后机体免疫系统紊乱中，它起着关键作用，从巨噬细胞着手研究伤后免疫功能紊乱的机制及其在创伤性急性肺损伤发病中的作用具有重要意义。目前研究显示，肺泡巨噬细胞(AM)在伤后分泌TNFα增强，这在创伤后的肺部感染中具有重要作用[2]。但是，单纯以AM在创伤后的功能变异难以解释肺泡及肺间质的感染，以及其它一些复杂的病理生理反应。近年来人们发现，正常情况下，肺部还存在间质巨噬细胞(IM)，AM与IM在功能上存在明显的异质性，然而，此两类巨噬细胞亚群在严重胸部创伤后分泌TNFα、IL6存在怎样的差异，目前还不清楚。为此，我们在建立了两类巨噬细胞亚群分离纯化方法的基础上，采用严重胸部创伤复合内毒素攻击模型，动态观察两类细胞创伤前后分泌功能的差异，为创伤后急性肺损伤的发病机制提供一定理论依据。

　　材料与方法

　　1 严重胸部创伤模型及动物分组

　　Wistar大鼠(第三军医大学动物研究所提供)，雌雄不拘，体重150～200g。动物乙醚吸入麻醉后，左侧45°卧位，采用小型多功能生物撞击机以400kPa压力撞击腋前线第4肋间。分别对伤后1、24小时动物死亡率进行观察，同时参照器官损伤定级(OIS)和AIS90标准对死亡动物以及伤后24小时活杀的动物尸检验伤，确定肺组织损伤程度。动物随机分为对照组及创伤后2、4、8、16、24小时组，共6组，每组10只。致伤前12小时禁食、自由饮水。对照组单纯麻醉不致伤。

　　2 肺泡巨噬细胞(AM)与间质巨噬细胞(IM)的分离培养[3]

　　动物腹腔注射20%乌拉坦麻醉，打开胸腔，充分暴露心肺，经右心室将一导管插入主肺动脉并固定，于肝脏上方切断主动脉。4℃冷PBS经导管反复灌洗肺血管床，至肺脏表面呈苍白色胶冻状。从胸腔取出气管及肺脏，PBS(无Ca2+、Mg2+，pH 7.4，37℃)行气管支气管肺泡灌洗，反复10～15次，直至镜下偶见肺泡巨噬细胞。将灌洗后的肺组织剪碎至1mm3以下，加入20ml酶消化液中(含胶原酶140u/ml，DNAse50u/ml)，在37℃恒温震荡水浴箱中消化1小时，200目钢网过滤。将收集到的灌洗液及消化液分别离心1000r/min，10分钟，RPMI1640培养液悬浮细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养2小时，洗去未贴壁细胞，胰酶消化贴壁的巨噬细胞，调整细胞浓度为1×105/ml备用。瑞氏染色法鉴定巨噬细胞纯度>90%; 台盼蓝染色，细胞存活率>95%。

　　3 电镜观察

　　取创伤后大鼠8只，分别于伤后8、24小时剖胸，留取致伤大鼠挫伤区(右肺上叶)肺组织，标本取材后立即切成1mm3大小，以0.3%戊二醛固定，再用1%的四氧化锇固定，梯度丙酮脱水后，环氧树脂包埋，行超薄切片，透射电镜观察。

　　4 肺泡与间质巨噬细胞分泌TNFα、IL6检测

　　按照分组分别提取上述方法纯化的大鼠AM、IM悬液1ml(浓度为1×l06个/ml)加入24孔细胞培养板，置CO2培养箱内于5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养1小时，倾去培养液，用温DHanks应用液洗去未黏附细胞(至少3次)，各加入1ml RPMI1640完全培养液(分LPS-组及LPS组+，LPS终浓度为100ng/ml)，置CO2培养箱内于5%CO2、37℃、饱和湿度条件下分别培养2小时，取培养上清离心分装用于测TNFα、24小时取培养上清离心分装用于测IL6，置-70℃条件下保存待测。采用ELISA法检测，按试剂盒说明操作。

　　5 主要仪器和试剂

　　小型多功能生物撞击机(第三军医大学交通医学研究所研制)，大鼠TNFα ELISA试剂盒(DIACLONE公司，FRANCE)，大鼠IL6 ELISA试剂盒(ENDOGEN公司，USA)，LPS(Escherichia coli.0111:B4)、胶原酶和DNAse购自Sigma公司，RPMI1640购自Hyclone公司。

　　6 实验所得数据资料分别用均值±标准差(±s)表示，使用SPSS 10.0统计软件行单因素方差分析及独立样本T Test进行数据分析。P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有非常显著性差异。

　　结果

　　1 伤后大鼠出现呼吸急促、口唇发绀、苏醒延迟、精神萎靡、食欲减退、活动减少、毛发竖立等表现，部分大鼠口鼻出现血性分泌物，少数大鼠还出现寒战。平均AIS评分为4.15±0.24，器官损伤定级在较重与重度范围，1小时死亡率为40%，24小时死亡率为52%。电镜下见毛细血管内红细胞淤滞，炎细胞与血管内皮细胞黏附、Ⅱ型上皮细胞水肿，板层小体脱颗粒、空泡化，数目减少，细胞核固缩、核周间隙增大。肺泡腔内见中性粒细胞、单核巨噬细胞和大量红细胞渗出，达到严重胸部创伤程度。

　　2 创伤后AM、IM分泌TNFα增加，4小时达高峰，随后逐渐降低，伤后24小时恢复至伤前水平; 内毒素(LPS)刺激后进一步增加其分泌水平，且其变化趋势相似。AM复合LPS刺激在伤后24小时仍高于正常水平。伤后4、8、16小时相点AM分泌TNFα显著高于IM。(见表1)

　　3 创伤后AM、IM分泌IL6增加，8小时达高峰，伤后IM分泌IL6强于AM，在伤后24小时仍高于伤前水平，且与AM相比P<0.01; LPS刺激后进一步增加其分泌水平，且其变化趋势相似，在伤后每个时相点IM分泌IL6均显著高于AM。(见表2)

　　表1 AM、IM创伤前后TNFα变化(略)

　　与正常对照比较：*P<0.05，**P<0.01; AM与IM相比：#P<0.05，##P<0.01

　　表2 AM、IM创伤前后IL6变化(略)

　　与正常对照比较： * P<0.05，**P<0.01; IM与AM相比：# P<0.05，##P<0.01

　　讨论

　　活化的巨噬细胞分泌多种生物活性物质，是炎症介质、细胞因子、脂质代谢产物等合成与释放的主要场所[4]。创伤、感染等刺激因素作用于机体，首先激活巨噬细胞，释放一系列细胞因子，后者进而作用于中性粒细胞、内皮细胞等效应细胞，因此，巨噬细胞在创伤后ALI的始动环节中具有重要作用[5]。而且，在创伤后的免疫紊乱病理过程中，肺内巨噬细胞是一个关键性参与者。特别是由于肺间质巨噬细胞分离方法复杂，获取较困难，使大部分研究局限于肺泡巨噬细胞，有关IM的研究资料报道较少[3,6]，其在严重胸部创伤后分泌功能的变化尚未见相关报道。

　　我们通过严重胸部创伤复合内毒素攻击致急性肺损伤模型观察其在细胞因子分泌中的作用。研究发现，创伤后AM、IM分泌细胞因子IL6、TNFα增加，但增加形式存在明显差异，提示创伤对二者的影响有所不同。创伤后AM、IM分泌TNFα增加，4小时达高峰，随后逐渐降低，伤后24小时恢复至伤前水平; LPS刺激能进一步增加其分泌水平，且其变化趋势相似，在伤后4、8、16小时时相点AM分泌的TNFα均显著高于IM，提示AM产生TNFα能力明显强于IM。TNFα在创伤后炎症中，是一具始动和关键性作用的促炎免疫分子，也是伤后出现最早的细胞因子，它的许多作用被认为是创伤后机体免疫功能紊乱的可能机制[7]。另一方面，我们实验结果还发现，创伤后AM、IM分泌IL6均增加，8小时达高峰，持续至伤后24小时; 复合LPS攻击能进一步增加其分泌水平，在伤后每个时相点IM分泌的IL6均显著高于AM，提示IM产生IL6能力强于AM。IL6可促使B细胞产生免疫球蛋白，诱导T细胞增殖，更重要的是参与急性期反应，具有急性期免疫调节作用，是细胞因子家族中的核心成员，具有多种生物活性，调节创伤后机体免疫紊乱状态[8]。AM、IM在创伤后分泌细胞因子的不同方式进一步证实巨噬细胞亚群间存在功能异质性，它们对器官损伤的反应截然不同，有研究表明，急性损伤后肌肉炎症中巨噬细胞亚群具有不同作用，创伤可通过影响巨噬细胞的分化状态而产生不同功能表现[9]。因此我们认为，由于创伤应激，使巨噬细胞活化，但由于AM与IM处于不同分化阶段，从而使其分泌方式存在差异，AM大量分泌TNFα，导致炎症级联反应的进一步扩大，并进而引起全身炎症反应，而IM由于直接存在于肺间质内，较低产生TNFα的能力有利于减轻肺组织损伤; 相反，IM较强的分泌IL6能力有利于对创伤后免疫紊乱状态进行调节，调控细胞因子网络的平衡，抑制过度炎症对机体带来的损害。有研究认为，IL6具有脑保护作用，脑缺血再灌注时，它有可能对抗其它细胞因子的损伤作用[10]; 还有作者发现，在烧伤面积大于60%烧伤患者，存活者血中IL6水平始终高于死亡者，还发现IL6可降低增高的外周血管阻力，恢复氧分布和氧耗，从而改善血液灌流，这可能是患者得以存活的原因[11]。

　　本实验首次观察到AM分泌TNFα的能力强于IM，而IM在分泌IL6等免疫功能调节因子方面具有更重要的作用，提示AM与IM在创伤后机体免疫紊乱病理过程中具有不同作用，特别是肺组织由于在解剖上存在免疫分隔(immunologic compartmentalization)，导致肺实质内存在多种免疫反应状态，IM较弱分泌TNFα和较强分泌IL6的特点，有利于减轻伤后局部肺实质的炎性损伤、增强免疫防御的能力。因此，IM是一个具有高度免疫活性的细胞，不应被单纯看作是AM的前体细胞。

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