MMP7在食管癌及癌旁组织中的表达差异的研究

　　作者：孙晓宏， 庞作良， 罗洞波 作者单位：(新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科， 新疆乌鲁木齐830011)

　　【摘要】 目的探讨基质金属蛋白酶7(MMP7)在食管癌癌组织及其癌旁组织中的表达。方法采用RTPCR方法检测MMP7在60例食管癌组织及其相应癌旁组织中的表达。结果MMP7在癌组织中阳性率为90.0%(54/60)，其对应癌旁组织中阳性率为48.3%(29/60)。经RTPCR半定量分析，食管癌组织与其癌旁组织中MMP7的表达量差异有统计学意义(P<0.05)。MMP7的表达与肿瘤侵润深度及淋巴结转移有关(P<0.05)。结论MMP7的表达可能与食管癌的早期进展和程度有关。

　　【关键词】 食管鳞癌; 基质金属蛋白酶7; 逆转录聚合酶链式反应

　　Study on the different expression of MMP7 in cancerous tissue and its

　　paracancerous tissue among esophageal cancer patientsSUN Xiaohong，PANG Zuoliang，LUO Dongbo

　　(Department of Surgical Thorax, Affiliated Tumor Hospital, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830011, China)Abstract: ObjectiveTo study the expression of Matrix metalloproteinase7 (MMP7) in cancerous tissues and its paracancerous tissues among esophageal cancer patients. MethodsUsing RTPCR to detect the expression of MMP7 in 60 cases of esophageal cancer tissues and its paracancerous tissues. ResultsThe positive rate of MMP7 expression were 90.0%(54/60) in esophageal cancer tissues, 48.3%(29/60) in paracancerous tissues. Analyzed by semiquantitative RTPCR, there was significant difference in the expressions of MMP7 between cancerous tissues and its paracancerous tissues (P<0.05). There was a relationship between expression of MMP7 with tumor invasion and lymph node metastasis (P<0.05). ConclusionsMMP7 may function in early stage esophageal squamous cell carcinoma.

　　Key words： esophageal squamous cell carcinoma; Matrix metalloproteinase7; RTPCR食管癌是世界上最具有侵袭性的恶性肿瘤之一，且因该病发现较晚、临床进展迅速和低生存率引起人们关注[1-2]。食管癌进展是一个极其复杂的多步骤的过程，包括肿瘤细胞脱离、局部侵润、血管增生和肿瘤细胞生长及转移到其他组织中[3]。而细胞外基质降解和新生血管形成是肿瘤生长、侵润和转移的必要条件[4]。因此,参与此过程的一些细胞因子引起学者们广泛的研究。本研究应用逆转录多聚酶链反应( RTPCR) 技术检测基质金属蛋白酶7 (MMP7)基因在食管癌组织及相应的癌旁组织中的表达情况，并探讨其在食管癌发生、发展及转移中的作用。

　　1材料与方法

　　1.1材料本组60例食管癌组织及相应癌旁组织标本取自新疆医科大学附属肿瘤医院2007年12月～2009年7月行根治性手术切除的食管癌标本，均为鳞癌。男性43例, 女性17例，年龄36 ～75 岁, 平均 60岁。临床分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期22例，Ⅲ期36例。淋巴结转移36例，无淋巴结转移24例。高分化3例，中分化42例，低分化15例。

　　1.2试剂和仪器RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒购自Promega公司，PCR即用试剂盒购自上海生物工程有限公司，琼脂糖、溴化乙锭(EB)、氯仿、异戊醇、无水乙醇、异丙醇由新疆医科大学基础医学院科研中心提供，PCR扩增仪icycler型(BioRad;美国)，DC2000凝胶成像分析仪(BioRad;美国)。

　　1.3方法

　　1.3.1总RNA的提取按Trizol 法总RNA提取试剂盒说明进行。取1 μg所提取的组织RNA，在紫外分光光度计下测定OD260、OD280及其比值，以确定所提取RNA的浓度和纯度在1.8～2.1，同时取5 μl RNA在1.2%的琼脂糖凝胶电泳，观察所提取RNA的18 S、28 S条带，以确定提取的RNA的质量。

　　1.3.2cDNA合成及PCR反应取稀释的总RNA标本1 μl加oligo(dt)引物l μl，双蒸水9 μl，混匀后置于72℃10 min，取出后置于冰上逐次加入MgCl2 4 μl，dNTP2 μl，10倍反应缓冲液2 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，逆转录酶0.5 μl (5 U)，混匀后置于42℃1 h，用95℃5 min终止反应，取出后置于冰上，加80 μl双蒸水，得到100 μl逆转录产物。PCR扩增体系反应体系为20 μl，其中含逆转录标本1 μl，各基因上下引物各1 μl，即用PCR反应试剂盒反应溶液(2倍浓度)10 μl，双蒸水7 μl。引物序列及PCR产物大小及PCR扩增条件见表1。表1引物序列、PCR产物大小及PCR扩增条件基因引物序列(5′→3′)大小(bp)RTPCR 程序GADPHF: GCGGGCTCTCCAGAACATCAT

　　R: CCAGCCCCAGCGTCAAAGGTG29895℃5 min后，95℃30 s→59℃30 s→72℃60 s，扩增35个循环;72℃7 min。MMP7F: ATGTTAAACTCCGCGTCATA

　　R: CAGCATACAGGAAGTTAATCC

　　R: GGCTGGTCAGTGGCTTGGGGTA41895℃5 min后，95℃30 s→53℃30 s→72℃30 s，扩增35个循环;72℃7 min。

　　1.3.3产物鉴定取5 μl PCR反应产物加入1 μl上样缓冲液，经2%的琼脂糖凝胶电泳后，在DC2000凝胶成像分析仪下分析并保存结果。

　　1.4统计学处理应用SPSS 11. 5软件对数据进行统计分析，采用t检验及χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1MMP7在癌组织及癌旁组织中的表达通过RTPCR分析，所有60例食管癌患者的癌组织中MMP7的表达阳性率为90.0%(54/60)，其相应的癌旁组织中MMP7表达阳性率为48.3%(29/60)。MMP7在癌组织及其相应的癌旁组织的表达差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2MMP7的表达与食管鳞状细胞癌临床病理因素的关系MMP7的表达与肿瘤侵润深度及淋巴结转移有关(P<0.05)，其他均与临床因素无相关性(表2)。

　　表2食管癌组织中MMP7的表达与临床病理特征的关系 病例资料例数MMP7表达水平性 别男性430.678 2±0.128 2女性170.817 0±0.185 7分化程度低分化150.610 1±0.173 6高、中分化450.990 0±0.178 8肿瘤侵润深度T1、T2100.260 0±0.182 8*T3、T4501.023 9±0.162 6淋巴结转移无240.640 3±0.137 2*有361.065 0±0.215 1注： *P<0.053讨论MMPs是一类具有降解细胞外基质和基底膜能力的蛋白水解酶，目前在人类MMP基因家族中已超过20个成员，而且根据结构和底物特异性分为胶原酶、间质溶解素和明胶酶[5]。近年研究显示在肿瘤细胞逃逸转移中起重要作用[6]。本研究显示在食管癌组织中MMP7的表达明显高于其癌旁组织，并且MMP7的表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关。因MMP7在MMPs家族中有着极为特殊的结构，且MMP7只表达于肿瘤细胞;其高表达还能激活家族中其他成员，对ECM有广谱降解作用[7]，故MMP7在肿瘤发生、发展中起着更为重要的作用。MMPs主要是通过对基底膜的水解作用促进转移。王瑞婷等[8]研究认为MMP7能降解细胞膜上的Fas配体，抑制Fas介导的细胞凋亡，从而间接促进肿瘤VEGF的分泌。总之，食管癌的发生、发展是个多基因、多步骤的反应过程， MMP7在其中起了非常重要的作用，与肿瘤早期进展和程度可能具有一定的关系，并可能与食管癌的发生、发展有关，其表达的上调可能是食管癌发病的机制之一，对MMP7的检测可评价肿瘤的恶性程度及预后，并为进一步阐明食管癌的发生、发展及转移提供了实验依据。

　　【参考文献】

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　　[3]Lagarde SM, Kate FJW, Richel DJ, et al. Molecular Prognostic Factors in Adenocarcinoma of the Esophagus and Gastroesophageal Junction[J]. Ann Surg Oncol，2007,14:977991.

　　[4]Gu ZD, Li JY, Li M, et al. Matrix metalloproteinases expression correlates with survival in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Am J Gastroenterol,2005,100:18351843.

　　[5]Gu ZD, Chen KN, Li M, et al. Clinical significance of matrix metalloproteinase9 expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. World J Gastroenterol，2005,11(6):871874.

　　[6]Ahokas K, KarjalainenLindsberg ML, Sihvo E, et al. Matrix metalloproteinases 21 and 26 are differentially expressed in esophageal squamous cell cancer[J]. Tumor Biol,2006,27:133141.

　　[7]Zhang JH, Jin X, Fang SM, et al. The functional polymorphism in the matrix metalloproteinase7 promoter increases susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma, gastric cardiac adenocarcinoma and nonsmall cell lung carcinoma[J]. Carcinogenesis,2005，26 (10)：17481753.

　　[8]王瑞婷, 申兴斌, 梅爱敏, 等. 基质金属蛋白酶7和血管内皮生长因子与大肠癌进展及预后的关系[J].广东医学，2006，9(27)：13191322.