骨桥蛋白反义基因在肺癌浸润与转移中的作用

　　作者：徐沛然 杨志广 赵慧敏 邵国光 作者单位：吉林大学第二医院胸外科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 探讨骨桥蛋白(OPN)反义基因对肺癌细胞增殖和浸润转移的影响。方法 (1)PCR扩增获得人OPN基因，pcDNA3.1(+)载体连接。酶切、测序。(2)脂质体介导将pcDNA3.1ANOPN基因转入ECA 109，G418筛选获得稳定表达ANOPN基因的转染细胞A54ANOPN，及表达空载体的A54vect细胞，空白对照A54。RTPCR检测mRNA。体外观察对比各组间倍增时间、黏附、侵袭及迁移能力的差异。结果 成功构建了pcDNA3.1ANOPN质粒，测序结果与GenBank中公布的序列同源性为100%。与A54vect、A54相比，A54ANOPN细胞OPN mRNA表达明显降低;倍增时间增加;黏附、侵袭及迁移能力明显降低。结论 ANOPN基因的稳定表达明显抑制肺癌细胞的恶性表型。

　　【关键词】 骨桥蛋白;肺癌;反义基因治疗

　　研究发现肺癌、结肠癌、胃癌、十二指肠癌、肝癌、胰腺癌、食管癌等多种肿瘤细胞均有骨桥蛋白(OPN)的过量表达〔1〕，动物实验和临床研究均证实OPN的过量表达与肿瘤的发生和进展密切相关。Chamber等〔2〕用Northern blot和免疫组化技术对肺癌进行分析，结果表明与各自正常的肺组织相比，大多数肿瘤过度表达OPN mRNA，在OPN染色阳性的标本，肿瘤浸润区中的巨噬细胞和坏死灶呈现染色反应，少量是肿瘤细胞，OPN染色阳性的肿瘤与病人的预后关系有统计学意义，说明肺癌中的OPN水平在临床可以作为判断病人预后的指标。国内对于构建反义OPN基因的重组质粒鲜有报道。本实验构建了反义OPN基因的重组质粒(pcDNA3.1ANOPN)，探讨其在肺癌细胞浸润与转移中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞、细菌菌株及质粒载体

　　真核表达载体pcDNA3.1(+)购自invitrogen公司。A54肺癌细胞株由大连宝生物公司鞠险峰馈赠。

　　1.2 反义OPN基因重组质粒pcDNA3.1ANOPN的构建

　　以GenBank公布的人OPN序列为参照，用Primer 5.0软件设引物如下：上游引物：5'GCGCTCGAGCATACCAGTTAAACA3';下游引物：5'GCGAAGCTTCCGGGTTAATTCCG3'。cDNA为模板，用OPN引物扩增目的基因。PCR循环条件：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环，72℃后延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳，PCR产物回收。按TaKaRa公司T载体连接试剂盒使用说明书进行目的基因的克隆及序列测定。氯化钙法制备感受态大肠杆菌，转化连接产物。转化菌质粒DNA提取使用Promega公司提取纯化试剂盒WizardTM Plus Minipreps，具体操作按使用说明书进行。

　　阳性克隆送大连宝生物公司测序，GenBank Blast等软件进行序列同源性分析。

　　用Xho I和Hind Ⅲ 双酶切重组质粒pMD18TOPN及pcDNA3.1(+)载体，回收目的片段和载体片段用T4连接酶连接，构建重组质粒pcDNA3.1ANOPN。对重组质粒用Xho I和Hind Ⅲ双酶切，送大连宝生物公司进行测序，用GenBank Blast等软件进行序列分析。

　　1.3 脂质体转染

　　细胞转染分为3组：A组为实验组，转染含pcDNA3.1ANOPN质粒者命名为A54ANOPN;B组为实验对照，转染空载体pcDNA3.1质粒者命名为A54vect;C组为空白对照，只加入等量脂质体，命名为A54;72 h后加G418筛选阳性克隆，扩增。

　　1.4 MTT比色法绘制细胞生长曲线

　　对数生长期A54ANOPN与A54vect及A54，胰酶消化，接种于96孔板，加含10%小牛血清的RPMI1640培养液。已未接种细胞的孔作空白对照，37℃，5% CO2培养箱培养。MTT比色法，参照波长630 nm，检测波长570 nm，A值代表活细胞的多少。取其A值平均值为纵轴，培养时间为横轴绘制曲线。

　　1.5 RTPCR检测OPN mRNA表达

　　Primer 5.0软件以GenBank公布的人OPN序列为参考，设计引物及内参βactin引物如下：上游：5′AAGCCTGACCCATCTCAGAA3′;下游：5′GCAACTGGGATGACCTTGAT3′;扩增片段长度446 bp。βactin引物序列为：上游：5′TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC3′;下游：5′ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG3′;扩增片段180 bp。引物由大连宝生物公司合成。

　　以cDNA第一链为模板进行OPN及βactin基因的扩增：1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察。以OPN与βactin电泳条带的光密度比值作为OPN mRNA的相对表达量。按下列公式计算OPN产物的相对量：OPN相对量=OPN产物电泳条带密度/βactin产物电泳条带密度×100。

　　1.6 Transwell法测定细胞的迁移能力〔3〕

　　用NIH 3T3细胞上清液作为趋化剂，诱导肿瘤细胞穿过Transwell小室内聚碳酷滤膜，但其表面不铺Matrigel，后续步骤与侵袭实验相同。通过计数穿过膜的细胞数即反映细胞的迁移能力。

　　1.7 统计学处理

　　全部数据经SAS10.1统计学软件处理，率的比较采用χ2检验，各指标与生存时间之间的关系通过Cox模型回归分析。

　　2 结 果

　　2.1 pcDNA3.1ANOPN质粒测序结果分析

　　pcDNA3.1ANOPN 阳性质粒送上海生工生物工程公司测序，测序结果用DNA star软件进行同源性比较，结果同源性为100%，无碱基突变，OPN基因已正确地反向插入到pcDNA3.1(+)载体HindⅢ 和xhoⅠ位点中。同时对测序结果用GenBank Blast与NCBI基因库中登陆的序列分析，结果完全一致，无碱基发生突变。

　　2.2 细胞生长曲线的绘制

　　A54、A54vect及A54ANOPN细胞生长曲线如图1所示：A54ANOPN细胞的生长速度明显慢于A54和A54vect细胞，而后两种细胞的生长速度相近。A54ANOPN的倍增时间(39.27 h)是A54细胞(23.45h)的1.67倍(P<0.05)和A54vect细胞(25.10 h)1.56倍(P<0.05)，说明反义OPN基因对肺癌细胞的生长有抑制作用。

　　2.3 细胞中OPN mRNA表达情况

　　A54ANOPN细胞、A54vect细胞和A54细胞中产物与βactin比值分别为23.20、74.20和72.45，说明A54ANOPN细胞中OPN mRNA表达水平明显下降，反义OPN基因抑制了细胞中OPN mRNA的表达，所构建的反义OPN基因载体较为成功。

　　2.4 三组细胞侵袭能力的测定结果

　　体外侵袭力以侵入滤膜的细胞数来判定，3组细胞中，A54ANOPN侵袭力最弱〔侵入滤膜的细胞(40.25±6.13)个〕;其次A54vect(78.00±9.13)个;A54细胞侵袭力最强(81.26±10.00)个。A54ANOPN细胞的侵袭力与A54vect、A54组间比较均有显著性差异(P<0.01)。

　　2.5 三组细胞迁移能力的测定结果

　　A54ANOPN的迁移能力〔穿过膜的细胞数为(50.12±5.25)个〕较A54〔(88.02±10.11)个〕及A54vect〔(89.05±10.55)个〕细胞明显降低，差异具显著性(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　OPN是首先在骨基质中发现的一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，其中含有特异的与细胞黏附有关的RGD序列，通过其受体整合素、CD44等促进细胞的趋化、黏附和迁移〔3〕。研究发现，OPN参与了乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌等的转移，OPN高表达者预后差：Gotoh等〔4〕报道，肝癌组织中OPN有过度表达，且有转移者表达更高。OPN通过刺激细胞信号转导促进肿瘤恶性发展并能加强转移性细胞的生存，Zhang等〔5〕报道，肝癌中OPN的表达受PI3K/Akt信号通道的调控;基质来源的肿瘤，如：恶性胶质瘤纤维肉瘤、成骨肉瘤、膀肌癌、宫颈癌、结肠癌和卵巢癌，与OPN表达增强有关;OPN的过表达与人胃癌的进展有关，分化差的胃癌，OPN与CD44V9协同表达，并可促进胃癌的淋巴转移。近年来，OPN与肿瘤转移的关系日益引起人们的关注，已被广泛公认为是肿瘤转移相关基因(metastasisassociated genes)或称转移基因(metastasisgene)〔6〕，并已成为肿瘤治疗的靶点。

　　研究发现，OPN在肝癌、肺癌、乳癌〔7〕及头颈部肿瘤等原发肿瘤及其转移瘤组织中高表达，提示OPN可能在肿瘤发生及侵袭转移过程中具有重要作用〔8〕。最近的临床研究提示OPN不仅与多种类型的肿瘤相关，而且OPN在患者血液和肿瘤组织中的高表达有助于肿瘤预后信息的判断〔9〕。Coppola等〔1〕采用免疫组织化学技术对350例肿瘤组织和113例不同部位的正常组织OPN表达进行了检测，结果发现100%胃癌细胞OPN表达阳性，85%结肠癌、82%肾盂移行细胞癌、81%胰腺癌、72%肾细胞癌、71%肺癌和子宫内膜癌、70%食管癌、58%头颈部鳞状细胞癌和59%卵巢癌等OPN表达阳性。说明OPN广泛表达在人体不同肿瘤组织中并参与肿瘤的形成。同时OPN表达在不同类型肿瘤组织和不同的肿瘤病理分级，其表达程度亦存在着差异，说明OPN可能参与肿瘤的侵袭与转移过程〔1〕。

　　Chamber等〔2〕用Northern blot和免疫组化技术对肺癌进行分析，与各自正常的肺组织相比，大多数肿瘤过度表达OPN mRNA。在OPN染色阳性的标本，是肿瘤浸润区中的巨噬细胞和坏死灶呈现染色反应，少量是肿瘤细胞。OPN染色阳性的肿瘤与病人的预后关系有统计学意义，说明肺癌中的OPN水平在临床上可以作为判断病人预后的指标。

　　本实验选用含有巨细胞病毒(CMV)启动子的pcDNA3.1(+)真核表达载体，转染到哺乳动物细胞后能持续、高效表达，并含有neo+基因位点，能用于筛选转染细胞的重组细胞。成功地构建了pcDNA3.1ANOPN基因质粒。经脂质体转染，G418筛选，获得稳定转染pcDNA3.1ANOPN的阳性细胞A54ANOPN，及稳定转染pcDNA3.1空载体的阳性细胞A54vect。运用半定量RTPCR方法对3组细胞中OPN mRNA表达，显示A54ANOPN细胞中OPN mRNA表达水平明显下降，反义OPN基因抑制了细胞中OPN mRNA表的表达，所构建的反义OPN基因载体较为成功。

　　MTT法测定A54ANOPN细胞、A54vect细胞及空白对照细胞A54生长曲线，结果显示A54ANOPN细胞的生长速度明显慢于A54vect和A54细胞，而后两种细胞的生长速度相近，说明反义OPN基因对人肺癌细胞系A54细胞的生长有抑制作用。通过对3组细胞(A54、A54vect及A54ANOPN)的迁移能力的比较可以看出，转染含pcDNA3.1ANOPN质粒细胞A54ANOPN在转移能力上明显弱于空载体组细胞及对照组细胞。提示人OPN的表达量与人肺癌细胞的生长及转移能力呈正相关。

　　以上结果初步证明，ANOPN基因的稳定表达明显抑制人肺癌细胞的恶性表型，说明ANOPN在肺癌基因治疗中有重要意义，为其临床应用提供了理论和实验依据。

　　【参考文献】

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