热疗对肺癌A549细胞周期和凋亡的影响
发表时间：2010-08-18 浏览次数：487次
作者：蒋东，李 芳，沈文明，郑世营 作者单位：苏州大学附属第一医院胸心外科，苏州215006
【摘要】 目的：研究在不同温度、不同加热时间的条件下热疗对人肺腺癌A549细胞生长的影响。方法：不同温度、不同时间加热后，采用流式细胞技术观察热疗对人肺腺癌A549细胞株细胞周期和凋亡的影响。结果：流式细胞技术检测显示A549细胞经热疗处理后，细胞生长相应的滞留于细胞生长周期的G1期，细胞凋亡明显，细胞减少。热疗在不同温度、不同时间加热时间的条件下，导致A549细胞出现凋亡和坏死的程度不同，其中加热至42 ℃维持2 h处理组中凋亡最为明显。结论:热疗可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1期,并且在加热至42 ℃维持2 h时细胞凋亡最为明显。
【关键词】 肺癌;热疗;细胞周期;凋亡
The influence of thermotherapy on the cell cycle and apoptosis of pulmonary carcinosis A549 cell
1JIANG Dong，2LI Fang，1SHEN Wenming，et al (1Department of Cardiothoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006; 2Department of Histology and Embryology, Medical School of Soochow University)
[Abstract] Objective: To investigate the influence of thermotherapy on the growth of pulmonary carcinosis A549 cell under different temperature and heating time. Methods: The flow cytometry was adopted to observe the influence on the growth of cells, cell cycle, and the apoptosis of pulmonary carcinosis A549 cell, after the cell was treated by thermotherapy under different temperature and heating time. Results: The flow cytometer shows that the cell cycle of A549 cell was arrested in G1 phrase, the apoptosis was obviously, and the number of A549 cell was decreased. The apoptosis and cell necrosis degree of A549 cell was various among the different conditions of thermotherapy and in the group heated for 2 hours under 42 ℃, remarkable apoptosis could be observed. Conclusion: The proliferation of pulmonary carcinosis A549 cell was inhibited, the cell cycle of A549 cell was arrested in G1 phrase by thermotherapy, and remarkable apoptosis could be observed when the A549 cell was heated for 2 hours under 42 ℃.
[Keywords] Pulmonary carcinoma; Thermotherapy; Cell cycle; Apoptosis
近年来肿瘤热疗已成为继手术、化疗、放疗、生物治疗之后的对肿瘤的第5类有效治疗手段，但其机制还不完全清楚。本实验以我们培养的肺癌A549细胞株为研究对象，观察不同温度、不同时间热疗对其细胞周期及凋亡的影响。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况，以期对临床治疗提供有益的探索，并初步探讨其机制。
1 材料和方法
1.1 材料 人肺癌A549细胞株为苏州大学医学院分子生物实验室提供。RPMI1640培养基(Gibco)，小牛血清(杭州四季青)，水浴箱(北京长风公司)，培养箱(德国贺利氏集团公司)，低速离心机(北京医用离心机厂)，流式细胞仪Beckman FC500(美国)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 肺癌A549细胞常规在含10 %小牛血清的RPMI1640 培养液中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞生长汇合达85%时,用0.25%胰酶消化，按1∶3传代。实验时选取对数生长期细胞。
1.2.2 加温实验 将对数生长期细胞用0.25%胰酶消化、打匀，分装入无菌10 ml离心管。实验分为实验组和对照组：(1)不同时间热疗组实验组：将对数生长细胞放置入离心管中在42 ℃水浴中加热30 min，1 h，2 h，4 h;对照组将细胞消化装入离心管放置37 ℃水浴放置30 min，1 h，2 h，4 h;(2)不同温度热疗组实验组：将对数生长细胞放置入试管中分别在40 ℃，42 ℃，44 ℃，46 ℃水浴中加热1 h;对照组将细胞消化装入试管放置37 ℃水浴放置1 h。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡 将上述细胞离心后,新鲜培养液打匀继续37 ℃、5%CO2培养24 h，收集细胞，用4 ℃预冷的PBS洗2次，加70%的冰乙醇固定过夜后，脱乙醇离心弃上清后，预冷的PBS洗1次，加入含RNA酶(100 μg/ml)的PI(50 μg/ml)染液1 ml，避光30 min后上机检测。观察细胞周期的变化。分析软件为 PHOENIX FLOW SYSTEMS Multicycle AV for Windows。
1.2.4 统计学方法 结果用方差标准形式表示用SAS8.0进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
不同温度加热1 h细胞周期和凋亡指数变化见(表1、图1)。37 ℃和42 ℃加热作用不同时间细胞周期及凋亡指数变化见(表2、图2)。由表1和图1可以看出，与37 ℃组相比较，在40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃组各加热1 h，随加热温度的升高，G0/G1期细胞都明显减少(P<0.05)，S期和G2/M期细胞都明显增加(P<0.05)，凋亡指数也明显增加(P<0.05)。而在42 ℃、44 ℃，加热1 h组，G0/G1期细胞明显少于40 ℃、46 ℃组。凋亡指数则随着温度的升高逐渐增加，以42 ℃组最高，至44 ℃和46 ℃组凋亡指数逐渐减少 (P<0.05)。由表2和图2不难发现42 ℃组和37 ℃组相比较，在相同加热时间组上G0/G1期细胞都明显减少(P<0.05)，S期和G2/M期细胞都明显增加(P<0.05)，凋亡指数也都明显增加(P<0.05)。37 ℃组内细胞周期及凋亡指数无明显差异(P>0.05)。而在42 ℃组内，以加热2 h组的细胞周期变化最为明显，42 ℃，2 h组与其它不同加热时间组相比较，G0/G1期细胞明显减少(P<0.05)，S期细胞明显增加(P<0.05)，凋亡指数也明显增加(P<0.05)。
3 讨 论
热疗治疗肿瘤比较可靠的文献首推1866年德国医师Busch的报道。自上世纪60年代以来，热疗已悄然走进治疗领域，近20年来，在细胞生物、分子生物、蛋白质及基因等各个水平上关于热疗的基础研究都取得了明显的进步[1]。目前有关肿瘤热疗的生物学研究远远领先于临床应用，且侧重于临床应用。在临床实践中，常用热疗来配合肿瘤放疗和化疗以提高肿瘤综合治疗指数。在敏感组织中，加热42 ℃，30 min可以引起广泛的细胞凋亡，而加热到46 ℃或更高则产生坏死，且不同肿瘤对高温反应差别很大[2]。热作用对肿瘤细胞周期的影响,文献报道不尽相同[3 ,4]。本实验中肺癌A549细胞在加热后出现凋亡指数的增高，并随加热的温度和时间不同而出现差异。在不同温度中，42 ℃时凋亡明显，44 ℃次之，40 ℃和46 ℃相当。在42 ℃时加热2 h凋亡明显，1 h和4 h次之，30 min最弱。在细胞凋亡的同时伴随G1期细胞的减少，减少的程度和调亡指数成正相关，同时出现S期、G2/M期细胞比例的相对增多。这和Yuguchi等 [5]的报道研究是一致的。国内陈雪琴等[6]也有相关报道。本实验显示热疗诱导的肿瘤细胞凋亡出现在细胞周期的Gl期，其有关机制探讨如下：多项研究示热疗可引起细胞周期阻滞[7]，热疗后DNA聚合酶解聚，使DNA和RNA合成受抑，核分裂减少，同时热疗可诱导野生型p53、p21等的表达，进一步抑制多种周期素—细胞周期依赖激酶复合物的激酶活性，从而引起Gl期阻滞，抑制细胞周期进展。热疗是对细胞DNA的损伤，Gl期细胞阻滞是为DNA修复创造条件。若修复成功，细胞进入下一个细胞周期时象，若修复不成功或者不能修复，细胞则出现调亡[8]。受损的DNA在常温下短时间内能经DNA 修复酶予以修复, 但在加温状态下, 酶的活性受到抑制, 从而阻碍了DNA 的修复，抑制了RNA、DNA蛋白质的合成。Hilger等[9]在对荷瘤小鼠的热疗实验中也证实了小鼠肿瘤细胞DNA不可逆的损伤。所以加热后出现DNA损伤，并且在加热状态下不能得以修复，从而出现了Gl期阻滞细胞的大量调亡。而S期和G2细胞比例相对增高。大部分文献报道，化疗药物对S期细胞敏感。肿瘤细胞经热疗处理后，再联合运用化疗，可以明显增强化疗效果，相关研究将在今后的实验中验证。
【参考文献】
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[6] 陈雪琴,马胜林,牟翰舟,等.热化疗联合对人肺腺癌耐药细胞株A549/ DDP作用及其机制的实验研究[J]. 浙江临床医药, 2007, 9(2): 157-158.
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[8] 曾益新主编. 肿瘤学[M]. 第2版. 北京：人民卫生出版社,2003：169-170.
[9] Hilger I, Rapp A, Greulich KO, et a1. Assessment of DNA damage in target tumor cells after thermoablation in mice[J]. Radiology, 2005, 237 (2): 500-506.
