HIF-1α、VEGF-C在非小细胞肺癌中的表达及其与淋巴转移的关系

　　作者：丁彦光　 达嘎 李勇　武建英 作者单位：1.青海大学医学院;2.青海大学附属医院心胸外科

　　【摘要】 目的 探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其与淋巴转移的关系。方法 采用PV-9000免疫组织化学法检测58例NSCLC和20例癌旁对照肺组织中HIF-1α、VEGF-C的表达情况，并记数VEGFR-3标记淋巴管内皮细胞的微淋巴管密度(LMVD)。结果 HIF-1α和VEGF-C在NSCLC组的阳性表达率分别为65.5%和60.3%，明显高于癌旁对照肺组织 (P <0.05 );NSCLC组织中HIF-1α和VEGF-C的表达的高低与有无淋巴结转移、TNM临床分期密切相关(P<0. 05)，而与性别、年龄、病理组织类型以及肿瘤的分化程度无显著相关(P >0.05);LMVD在NSCLC组和癌旁对照组计数分别为6.6±2.4和2.9±1.7，差异有统计学意义(P<0.05);HIF-1α与VEGF-C的表达呈明显相关(rpearson=0.464，P <0.05)，HIF-1α与LMVD呈正相关(rs = 0.506，P <0.05)，VEGF-C与LMVD也呈正相关(rs = 0.608，P <0.05)。结论 HIF-1α及其靶基因VEGF-C在NSCLC中的表达明显上调， HIF-1α可能通过诱导VEGF-C的过表达参与NSCLC的淋巴管生成，在NSCLC的发生、发展以及转移过程中发挥着重要作用。 丁彦光(1982～)，男，汉族，山东籍，青海大学医学院2006级硕士研究生

　　【关键词】 非小细胞肺癌 HIF-1α VEGF-C 微淋巴管密度 免疫组织化学 淋巴转移

　　EXPRESSION OF HIF-1α AND VEGF-C AND THERELATIONSHIP OF LYMPHATIC METASTASISIN NON SMALL CELL LUNG CANCER

　　Ding Yanguang1，Da Ga2，Li Yong2，Wu Jianying2

　　(1. Medical College of Qinghai University;

　　2 .Department of cardiothoracic surgery, the Affiliated Hospital of Qinghai University)

　　Abstract Objective To investigate the expression of HIF-1α、VEGF-C and their relation to lymphangiogenesis and lymph node metastasis in non small cell lung cancer(NSCLC). Methods The expressions of HIF-1α and VEGF-C in 58 cases of NSCLC tissues and 20 cases of the adjacent tissues were detected by PV-9000 immunohistochemical technique. LMVD was determined by VEGFR-3 immunostaining. Results The positive rate of HIF-1α and VEGF-C expression in NSCLC was 65.5% and 60.3%,which is significantly higher than that in the adjacent tissues (P<0.05 ). There was a significant difference of HIF-lα and VEGF-C protein expression between NSCLC tissues and the adjacent tissues (P<0.01).The expression of HIF-1α and VEGF-C were both correlated with lymph node involvement (P<0.05) and TNM clinical stage (P<0.05),but no significant correlation between sex, age, pathological type and differentiation(P >0.05).The expression of HIF-1α was correlated with VEGF-C expression and LMVD(P<0.05). Conclusion Over expression of HIF-1α induces the tumor lymph angiogenesis in NSCLC by activating the transcription of VEGF-C gene .It may play an important role in the generation, development and lymphatic metastasis in NSCLC.

　　Key words NSCLC HIF-1α VEGF-C LMVD Immunohistochemistry Lymphatic metastasis

　　低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是Semenza等[1] 于1992年在缺氧诱导的肝细胞癌株Hep3B细胞的细胞核提取物中发现的一种转录因子，缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人的细胞中，是哺乳动物和人在缺氧条件下维持氧稳态的关键性物质。在缺氧条件下HIF-1α不仅能激活许多缺氧诱导基因的表达，而且还通过对缺氧诱导基因表达的调节，维持机体对缺氧的适应能力。有许多研究表明，HIF-1α在肿瘤细胞缺氧适应、能量代谢、肿瘤血管生成、侵袭转移中也发挥着重要作用。血管内皮生长因子-C(VEGF-C)是VEGF 家族中第一个被发现的淋巴内皮细胞生长因子，与肿瘤淋巴管形成、淋巴结转移及预后密切相关。在国内已有关于NSCLC组织中HIF- 1α、VEGF的表达与微血管密度关系的研究[2]，但尚未见到关于HIF- 1α、VEGF-C与微淋巴管密度(LMVD)关系的文献报道。本研究采用PV-9000免疫组织化学法，检测 HIF- 1α、VEGF-C 及LMVD在NSCLC和癌旁组织中的表达，分析 HIF- 1α与VEGF-C及LMVD间的关系，旨在探讨 HIF- 1α和VEGF-C在NSCLC的发生、发展以及淋巴转移中的临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　收集青海大学附属医院2007年6月至2008 年7月手术切除的并经病理确诊的58 例NSCLC患者肺癌标本，术前均未行化疗和放疗。男 42 例，女 16例，平均年龄61.3±9.1岁;鳞癌 31 例，腺癌 27 例;高、中分化癌 42 例，低分化癌16 例。临床分期按照2002美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)制订的 TNM分期标准分类：Ⅰ～Ⅱ期 39 例，Ⅲ～Ⅳ期 19例;有淋巴结转移22例，无淋巴结转移36例。选取对照组20 例，以距离肿瘤边缘 >5 cm的癌旁肺组织作对照，男性13例，女性7例，平均年龄56.6±6.9岁。所有标本均经 10%的福尔马林溶液固定、石蜡包埋、4 μm厚连续切片处理。

　　1.2 主要试剂及实验方法

　　即用型鼠抗人HIF-1α单克隆抗体、兔抗人VEGF-C多克隆抗体、兔抗人VEGFR-3多克隆抗体、PV-9000免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实验步骤严格按照PV-9000免疫组化说明书进行。以PBS代替一抗作空白对照。

　　1.3 结果判断标准

　　HIF-1α和VEGF-C阳性表达判断标准按Zhong等[3]报道的方法：无染色或<1%的细胞核染色为阴性(-);1% ～10%的细胞核染色，和(或)较弱的胞浆染色为弱阳性(+); 10% ～50%的细胞核染色，和(或)明显的胞浆染色为中等阳性(++); >50%的细胞核染色，和(或)较强的胞浆染色为强阳性(+++)。

　　微淋巴管密度(LMVD )判断标准及计数方法参照Weidner等[4]推荐的方法：凡染成黄色 (VEGFR-3表达阳性)、有单层内皮样细胞构成、周围没有明显的基底膜及平滑肌细胞、管腔内没有红细胞的管道，即认为是淋巴管。先在低倍显微镜(×10倍)下观察全切片的淋巴管分布情况后，选择淋巴管最密集的区域，即热点(hot spot)，然后在高倍显微镜(×40倍)下计数每个视野的淋巴管数，取5个视野的平均值作为每个标本的淋巴管密度。

　　1.4 统计学方法

　　计数资料用阳性例数和阳性率来表示，计量资料以( x±S)表示，采用SPSS13. 0统计软件包对计数资料行χ2检验，计量资料采用t检验，相关分析采用Spearman等级相关分析。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 HIF-1α、VEGF-C和LMVD在NSCLC和癌旁对照组织中的表达

　　HIF-1α主要表达于细胞的胞核，在胞浆中也有少量表达，如图1、2所示;VEGF-C主要表达于细胞的胞浆、胞膜和少量间质细胞，如图3、4所示;在肿瘤间质和癌周可见 VEGFR-3 阳性的微淋巴管，为棕褐色，呈条索状、管腔状或囊状，如图5、6所示。58例NSCLC组中HIF-1α和VEGF-C的阳性表达率分别为65.5%和60.3%，与20例癌旁对照组相比有统计学意义(P<0.05)。LMVD在NSCLC组和癌旁对照组计数分别为6.6±2.4和2.9±1.7，两组相比较有统计学意义(P<0.05)，见表1。

　　2.2 HIF-1α、VEGF-C在NSCLC中的表达与临床病理之间的联系

　　NSCLC组织中HIF-1α和VEGF-C的表达的高低与有无淋巴结转移、TNM临床分期密切相关(P<0. 05)，而与性别、年龄、病理组织类型以及肿瘤的分化程度无显著相关(P >0.05)，见表1。　表1HIF-1α、VEGF-C和LMVD在NSCLC和癌旁对照组织中的表达结果

　　2.3 HIF-1α、VEGF-C在NSCLC的表达与LMVD间的相关性分析

　　NSCLC组织中HIF-1α与VEGF-C的表达呈明显相关(rpearson =0.464，P<0.05)，HIF-1α的表达与LMVD呈正相关(rs = 0.506，P <0.05)，VEGF-C的表达与LMVD也呈正相关(rs = 0.608，P <0.05)。见表2、3。表3NSCLC组织中HIF-1α、VEGF-C与LMVD之间的相关性分析结果

　　3 讨论

　　低氧诱导因子-1是由HIF-1α 和HIF- 1β构成的异源二聚体，其中HIF-1α是主要的氧调节亚基;HIF-1β对氧的依赖性较弱，但对于HIF-1发挥作用是必不可少的。只有当两个亚单位聚合，发生适应性变化，并与下游缺氧反应元件(Hypoxiaresponse element，HER)结合后才能发挥相应的作用。HER是受HIF-1α调节的因子或酶所共有的且必须具备的一段基因序列，即5’-TACGTGCT-3’[5]。HIF-1α在缺氧条件下不仅能激活许多缺氧诱导基因的表达，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、红细胞生成素(EPO)等，还能通过对缺氧诱导基因表达的调节，维持机体对缺氧的适应能力，是哺乳动物和人在缺氧条件下维持氧稳态的关键性物质。有研究表明，HIF-1α在肿瘤细胞缺氧适应、能量代谢、肿瘤血管生成、侵袭转移中也发挥着重要作用。Zhong等[3]通过对179例肿瘤标本中HIF-1α表达研究发现，19种不同的肿瘤中有13种HIF-1α 呈不同程度的表达，其中在乳腺、结肠、前列腺的癌前病变中发现均有HIF-1α的过度表达，然而在乳腺、子宫的良性病变中则无HIF-1α的过度表达。另外 Marxsen 等研究发现，在肺癌等多种肿瘤组织中HIF-1α也呈过度表达，尤其是在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘HIF-1α表达明显增多，而肿瘤组织内的基质细胞和邻近的癌旁正常组织则未见HIF-1α的表达或低表达[6，7]，说明HIF-1α在肿瘤发生发展中起着重要作用。

　　本研究结果显示，58 例NSCLC组织中HIF-1α阳性表达率为 65.5% ( 38/58)，而在20例癌旁肺组织中HIF-1α呈低表达，阳性率仅为10.0% (2/20)，两者之间差异具有统计学意义(P<0.05)。本研究还提示，HIF-1α阳性表达与NSCLC患者性别、年龄、病理组织类型以及肿瘤的分化程度无显著相关(P >0.05)，这与Fan 等[8]对非小细胞肺癌的研究结果一致。

　　血管内皮生长因子-C (VEGF-C )属于VEGF和血小板生长因子(PDGF)家族，是由Joukov等[9]于1996年从人前列腺PC-3细胞系中分离纯化得出，是首个被发现的具有刺激淋巴管内皮细胞分裂增殖、诱导淋巴管生长的生长因子，又称淋巴管生长因子。VEGF-C受体有VEGFR-2和VEGFR-3，VEGF-C通过旁分泌方式与受体结合后使受体自身磷酸化，通过细胞内的信号传递，使DNA有丝分裂增加，导致淋巴细胞增殖[10]。目前认为，VEGF-C与VEGFR-2结合促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成; 而VEGF-C与VEGFR-3结合，促进淋巴内皮细胞增殖和淋巴管增生[11]。

　　本研究结果显示，在58例NSCLC中VEGF-C阳性率为60.3%(35/58)，其主要表达于癌细胞的胞浆中，而癌旁正常肺组织仅4例呈阳性，阳性率仅为20.0%，两者之间差异有显著性(P<0.05)。本研究还发现，NSCLC组织中经VEGFR-3标记的LMVD计数与淋巴结转移密切相关，有淋巴结转移组和无淋巴结转移组中的LMVD分别为8.27±2.15和5.59±2.00，淋巴结转移组明显高于不转移组，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，与Mandriota等[12]利用转基因技术对VEGF-C与淋巴管生成的关系研究结果一致。同时LMVD 计数还与TNM分期有关，表明LMVD是NSCLC淋巴结转的重要影响因素，其可能的原因是淋巴管数目的增多，增大了肿瘤细胞与淋巴管内皮接触的表面积，从而促使肿瘤细胞更容易进入淋巴管而发生淋巴结转移 [13]。

　　本研究还发现，NSCLC组织中HIF-1α、VEGF-C和LMVD之间呈明显相关，HIF-1α可能在多个层次调节VEGF的表达，其功能不仅包括增强VEGF的转录活性，还包括增加VEGF mRNA稳定性[14]，进而通过调节VEGF-C/ VEGFR-3信号系统，调控肿瘤淋巴管形成，促进肿瘤的淋巴转移。

　　总之，HIF-1α和VEGF-C在NSCLC的发生、发展过程中发挥着重要作用，对判断肿瘤的淋巴结转移、临床病理分期以及预后有重要参考价值;同时我们可以预见，随着对HIF-1α和VEGF-C研究的进一步深入，针对HIF-1α及抗淋巴管生成的研究有望成为一种用于肿瘤治疗的新方法。

　　【参考文献】

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