热休克蛋白70对供心一氧化氮及一氧化氮合酶表达的影响

作者：生伟,池一凡,孙忠东

作者单位：青岛大学医学院附属青岛市立医院心脏外科，山东 青岛 266071

     【摘要】  目的 探讨热休克蛋白70 (HSP70) 对供心一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的影响。方法 Wistar 大鼠18只,分为2组：对照组(C，n = 9)，腹腔注射生理盐水0.5 ml，24 h后取离体心脏灌注康斯特保护液（HTK液）,4℃保存3 h后建立Langendorff离体心脏灌注模型,灌注KH液2 h；实验组(E,n = 9)腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素(溶于生理盐水中)3.1μmol/kg(0.53mg/kg)，腹腔注射24 h后取离体心脏,处理方法同C组。测定心肌HSP70含量、NO、NOS的含量以及相关生化指标并做统计学处理比较。 结果 HSP70含量E组较C组明显增高(P<0.01) ,NO、NOS的含量E组较C组明显增多(P<0.01) ,生化指标E组明显优于C组。结论 心肌HSP70高表达对供心具有明显的保护效应，并且其促进心肌NO、NOS的表达,可能是HSP70发挥心肌保护作用的因素之一。

【关键词】  热休克蛋白70；一氧化氮；一氧化氮合酶

　　Effects of Heat Shock Protein 70 on Myocardial Expression of Nitric Oxide and Nitric Oxide Synthase of Donor Heart

　　SHENG Wei,CHI Yi-fan ,SUN Zhong-dong

　　(Department of Cardiovascular Surgery,Qingdao Municipal Hospital,Medical College of Qingdao University,Shandong Qingdao 266071,China)

　　Abstract: OBJECTIVE   To investigate the protection of heat shock protein 70 on donor heart and the effects on expression of myocardial cell nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) of isolated rat heart. METHODS  18 Wistar rats were randomly divided into 2 groups. Control group (C,n = 9) ,Normal saline 0.5ml was injected intraperitoneally and 24 hours later isolated hearts were stored in 4 ℃ for 3 hours with Histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solutions, and then isolated hearts were perfused for 2 hours by Langendorff model. Experimental group (E,n = 9), Noradrenaline Bitartrate 3.1μmol/kg(0.53mg/kg) was injected intraperitoneally and 24 hours later isolated hearts were stored in 4 ℃for 3 hours with HTK,and then isolated hearts were perfused for 2 hours with Krebs-Henseleit (K-H) solutions by Langendorff model. Myocardial HSP70 content , the expression of NO，NOS and related biochemical indicators were detected. RESULTS   HSP70 ，NO and NOS in E group are higher than those in C group and biochemical indicators in E group is better than that in C group . CONCLUSION  This study demonstrated that the high expression of HSP70 has obvious protection on donor heart ,and it can markedly affect the expression of NO，NOS of isolated rat heart and it is perhaps one of important factors for myocardial protection.

　　Key words：  Heat shock protein 70；Nitric oxide；Nitric oxide synthase

　　热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一组所有的细胞能在应激情况下由热休克基因所编码合成的序列高度保守的伴随细胞蛋白, 并能对抗更为严重的应激损伤, 研究发现在高温、缺氧、再灌注、局部损伤或感染等多种有害因素［1］刺激均可产生热休克蛋白。HSP70是HSP中最保守、最主要、含量最丰富的一类。实验表明一氧化氮(NO) 、一氧化氮合酶(NOS) 作为效应因子可介导心肌缺血再灌注损伤的保护作用, HSP70心肌保护作用是否与供心缺血再灌注后NO、NOS表达有关尚未可知,本实验的目的是探讨HSP70在发挥供心心肌保护作用时与NO、NOS的关系。

　1  资料与方法

　　1.1  实验动物和分组  雄性Wistar大鼠18只,体重250～350 g,由青岛市药检所动物中心提供,随机分为2组(n=9):对照组(C组):腹腔注射生理盐水0.5 ml,注射后24 h取离体心脏,灌注Histidine-tryptophan-ketoglutarate(HTK)心脏保护液,储存于4℃保存液中3 h,然后心脏行Langendorff灌注Krebs-Henseleit(K-H)液2 h；实验组(E组),腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素(溶于生理盐水中)3.1μmol/kg(0.53mg/kg)，24 h后取离体心脏,余处理步骤同C组。心脏灌流结束后取左室心肌组织测定。HTK液和KH液自行配制［2］，配制试剂购自上海惠兴生化试剂有限公司。

　　1.2  测定指标

　　1.2.1   心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）10min漏出率测定。复灌后10min ,留取冠脉流出液,置于-20℃冰箱中保存,以备测定心肌酶漏出量。全自动生化分析仪测定CK、LDH浓度。单位: IU/(10min·g)。CK(LDH)漏出率=CK（或LDH）（IU/L）×10min漏出液 1000×心肌湿重(g)

　　1.2.2   心肌含水量（MWC）测定。实验结束后在固定部位取心室肌约100 mg，先用滤纸吸干心肌表面水分，使用电子天平称心肌湿重。然后将心肌置入100℃恒温烤箱烘烤5 h，待恒重后称干重，计算MWC。单位：%。MWC= 心肌湿重-心肌干重心肌湿重×100% 。

　　1.2.3  心肌NO、NOS含量测定。试验结束后在同一部位取心肌组织约200 mg，吸干水渍后置入液氮保存。测定前称重，剪取100 mg左右心肌组织块,研磨成10 %匀浆,低温离心,取上清液,测定上清液中NO、NOS含量(化学法，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，严格按操作步骤进行测定)。

　　1.2.4   免疫组织化学法检测心肌组织HSP70含量。试验结束后在同一部位取左室心肌组织，10%甲醛液固定，制备石蜡切片。免疫组化染色严格按照说明书进行（采用SP法，试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供）。HSP70表达位于心肌细胞细胞质, DAB染色棕色颗粒为阳性产物。光镜观察后应用MPIAS-1000型多媒体彩色病理图像分析系统进行图像分析, 并自动测量染色阳性面积。每张切片随机选10个视野(×400) , 以染色阳性面积占视野面积的百分比的均值作为HSP70的表达量。

　　1.3  统计学方法  数据以均数±标准差( ±s )表示,使用SPSS 13.0统计软件进行t检验，相关关系采用直线相关分析。

　　2  结果

　　2.1  心肌HSP70、NO、NOS的含量  HSP70表达量E组明显高于C组(t=17.96，P<0.01)，见图1、图2；心肌NO、NOS的含量E组明显高于C组 (t=4.96，P<0.01；t=7.19，P<0.01) ,见表1。

　　表1  心肌HSP70表达、NO、NOS的含量（略）

　　注：*与C组比较，P<0.01

　　图1   E组HSP70表达（×400） （略）

　　图2    C组HSP70表达（×400）（略）

　　2.2  心肌生化指标  LDH和CK 10 min漏出率、MWC含量E组较C组明显降低(t=15.81，P<0.01；t=9.82,P<0.01；t=4.13,P<0.01),见表2。

　　表2   心肌组织的CK和LDH10min漏出率、MWC（略）

　　注：﹡与C组比较，P<0.01

　　3  讨论    　　热休克蛋白又称应激蛋白，参与细胞的损伤与修复。HSP70 是一族最保守和最重要的热休克蛋白家族。HSP70 在应激后生成最为显著, 它作为分子伴侣参与细胞内蛋白质的折叠、装配,维持某些肽链的伸展状态,以利其跨膜转位，在线粒体、内质网等不同的区域内发挥作用，在细胞的信息传递、生长、分化中具有重要的调控作用,同时它又可以促进某些变性蛋白质的降解清除，重新激活某些酶的活性，维持细胞的正常生理功能，作为一种内源性保护物质对脏器损伤产生自身保护作用［3］。目前国内外已有许多实验证明了HSP70在心肌缺血再灌中发挥了保护作用。NO、NOS 在心肌缺血再灌注中的作用引起人们的注意并进行了广泛的研究, 大量证据表明NO系统在缺血再灌注过程中扮演着重要角色, 但研究结果分歧较大。有人认为NO、NOS 可能是减轻心脏缺血再灌注损伤的保护性因素之一［4-6］，对HSP70发挥供心保护作用是否与NO、NOS有关，关系如何也少有报道。

　心脏移植是终末期心脏病确定的治疗手段 ,供心保护效果在很大程度上决定了移植的成功与否,并对移植后的远期疗效也起到重要作用。心脏移植过程要经历常温缺血、低温保存、以及缺血后的再灌注。目前理论研究和临床实践都证实了心肌缺血再灌注损伤的存在［7-8］,低温保存的目的是降低组织代谢, 减少缺氧组织对营养的需求, 但是也同时破坏了正常的生理状态, 一定程度上加重心肌结构和功能的损害［9］。本实验模拟心脏移植过程，将离体供心经过3个小时的低温保存（两组均采用目前成功应用于临床并具有卓越心肌保护作用的HTK液作为心肌保护液）后进行再灌注，结果表明，与C组比较, E组在再灌注期间,LDH、CK的漏出率及MWC含量减少, E组NO、NOS的含量明显高于C组，说明NO、NOS在心脏移植过程中对供心心肌缺血再灌注及低温保存期间的损伤具有保护作用。本实验证明心肌NO、NOS的含量与HSP70的表达呈明显的正相关(r =0.887，0.953) ，证实了HSP70可促进供心心肌细胞NO、NOS的表达，这也提示我们HSP70促进NO、NOS的表达可能是其发挥供心心肌保护作用的机制之一。

【参考文献】  　　［1］ Morimoto R, Sarge KD, A bravya K. Transcriptional regulation of heat shock genes:a paradigm for inducible genomic response［J］. J Bio l Chem,1992,267(31):21987-21990.

　　［2］ 张涛，高长青，李佳春，等.康斯特保护液对中低温离体大鼠心肌的保护作用［J］.中国体外循环杂志，2006，4（1）：33-35.

　　［3］ Gusarova V,Caplan AJ,Brodsky JL,et al.Apoprotein B degradation is promoted by the molecular chaperones HSP90 and HSP70［J］.J Biol Chem,2001,276(27):24891-24892.

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　　［5］ Hannan RL , John MC, Kouretas PC,et al. Deletion of endothelial nitric oxide synthase exacerbates myocardial stunning in an isolated mouse heart model ［J］. J Surg Res,2000,93(1) :127-132.

　　［6］ Zingarelli B, Hake PW,Yang Z,et al. Absense of inducible nitric oxide synthase modulates early reperfusion-induced NF-kappaB and AP-1 activation and enhances myocardial damage［J］ . FASEB J,2002,16 (3) :327-342.

　　［7］ 梅运清，龙村.HTK器官保存液对供心保护的研究进展［J］.医学综述，2001，7（12）：721-722.

　　［8］ 沈诚，范士志，陈建明,等. 二氮嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响［J］. 中国体外循环杂志，2006，4（1）：40-42.

　　［9］ 池一凡，孙忠东，许慧，等.不同热缺血时限对猪移植心脏的影响［J］.中华器官移植杂志，2004，25（3）：186.