血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌细胞的作用

　　作者：彭传亮 丛波 田辉 赵小刚 孙启峰 作者单位：山东大学第二医院胸外科，山东 济南 250033

　　【摘要】目的 探讨非小细胞肺癌(NSCC)中血管内皮生长因子C(VEGFC)信使核糖核酸(mRNA)的表达及其反义脱氧寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide，ASODN)对人肺癌细胞的作用。方法 应用原位杂交技术检测48例新鲜肺癌标本中VEGFC mRNA的表达，将脂质体介导的VEGFC ASODN转染人肺癌细胞株A549,用Western印迹法检测肺癌细胞VEGFC蛋白的表达。结果 VEGFC mRNA在肺鳞癌和腺癌细胞中的表达阳性率分别为65.4%(17/26)和59.1%(13/22)，经VEGFC ASODN转染的细胞株A549中，VEGFC蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。结论 VEGFC mRNA在NSCC中有一定程度的表达，体外实验VEGFC ASODN通过下调VEGFC蛋白的表达抑制肺癌细胞的侵袭作用。

　　【关键词】 血管内皮生长因子C;非小细胞肺癌;反义脱氧寡核苷酸

　　肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率增长最快、预后最差的恶性肿瘤之一，由于发病机制不清楚，死亡率颇高。虽然以手术为主的综合治疗近年来取得较大进步，但肺癌的生存率仍不甚理想，基因治疗成为目前研究的热点〔1〕。肺癌的淋巴转移是致死的一个重要原因，血管内皮生长因子C(VEGFC)是特异性的淋巴管内皮细胞生长因子，其促肿瘤细胞生长和血管生成的作用已有较多报道〔1〕。但本研究采用原位杂交技术，从基因水平检测VEGFC mRNA的表达，并通过体外实验，用VEGFC反义脱氧寡核苷酸(ASODN)转染肺癌细胞株，研究VEGFC蛋白的表达情况，为肺癌的基因治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本和细胞株

　　原位杂交标本为本院胸外科2006年9月至2007年7月经手术切除的48例新鲜非小细胞肺癌(NSCC)标本，其中鳞癌26例，腺癌22例;人肺癌细胞株A549购自中科院上海细胞所。

　　1.1.2 主要试剂

　　原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;寡核苷酸探针序列设计严格遵守分子杂交的原则，从GenBank查出人VEGFC的全长mRNA序列，序列号为NM_005429.2，用DNASTAR软件的“探针与引物设计功能”从全长序列中筛选出符合探针条件的最佳序列，将其在人类基因文库中与其他序列对比，确保其特异性，由上海生工公司合成并直接在5′末端标记地高辛，其序列如下：5′TGTACAAGTGTCAGCAAGG3′;正义脱氧寡核苷酸(sense oligodeoxyribonucleotide，SODN)、ASODN由上海生物工程公司合成并硫代磷酸化修饰;阳离子脂质体LipofectamineTM2000(LIP)购自美国Invitrogen公司;RPMI1640培养液为Gibco公司;Matrigel、Transwe11小室为美国BD公司产品;兔抗人VEGFC多抗以及辣根过氧化物酶标记二抗和显色系统均购自美国Santa Cruz公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集、制备与原位杂交

　　原位杂交新鲜组织在4%多聚甲醛中固定2～4 h，蔗糖溶液孵育过夜，切片。所用液体均用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制以防RNA酶污染，所用载玻片严格按原位杂交要求处理，切片机刀片用75%酒精处理，冰冻切片机连续6 μm切片，备用。原位杂交步骤包括杂交前预处理、杂交、杂交后处理及5溴4氯3吲哚磷酸/氯化硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)显色，阳性对照为人脑胶质母细胞瘤，阴性对照加不含探针的杂交液。原位杂交以胞浆中出现蓝紫色颗粒者判为阳性。

　　1.2.2 脂质体

　　寡核苷酸(ODN)转染复合物和预处理 ODNs序列采用硫代硫酸型ASODN序列为：5′AAGAAGCCCAGCAAGTGCAT3′;SODN序列为： 5′ATGCACTTGCTGGGCTTCTT3′。部分ODNs有荧光标记。按 Invitrogen公司LipofectamineTM2000说明书，ODN(μg)：脂质体(μl)=1∶2.5比例混合配制。根据转染复合物的类别分为4组：①空白对照组;②脂质体;③SODN组;④ASODN组，终浓度1 333 ng/ml，荧光显微镜下观察转染30 min细胞内便有荧光标记的ODNs出现，随着时间延长，细胞内荧光越来越强，转染6～12 h细胞内荧光最强。转染率70%左右。转染48 h后收集细胞进行检测。

　　1.2.3 Western印迹检测细胞VEGFC蛋白的表达

　　收集各组肺癌细(106),磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入预冷至4℃的裂解缓冲液，冰浴20 min，离心，取上清用紫外分光光度仪行蛋白定量，加入1/5体积的5×上样缓冲液，沸水煮沸5 min，以40 μl(64 μg)每道上样，10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至NC膜，4℃封闭过夜，加入1∶250稀释的VEGFC一抗，室温孵育2 h，Tris缓冲液(TBST)洗3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBST洗3次，加ECL化学发光剂，X线片暗室曝光，常规显影、定影。将胶片用凝胶成像仪扫描入电脑,用Quantity One4.4.0软件分析，得到所有条带的累积光密度值(IOD)，计算目的条带与βactin累积光密度值的比值。

　　1.3 统计学处理

　　统计数据以x±s，采用SPSS12.0软件进行方差分析和q检验。

　　2 结 果

　　2.1 VEGFC mRNA在NSCC的表达

　　VEGFC mRNA在鳞癌和腺癌中都有一定程度的表达,主要分布于肺癌细胞、血管内皮细胞和或纤维细胞,阳性表达率分别为65.4%(17/26)和59.1%(13/22)。见图1。

　　2.2 Western印迹检测各处理组VEGFC蛋白含量的变化

　　如图2所示，与空白对照组(0.48±0.03)、脂质体(0.45±0.02)组和SODN (0.36±0.02)组相比,ASODN(0.15±0.01) 组VEGFC蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　VEGFC作为VEGF家族的成员，具有淋巴管内皮细胞增殖和趋化的特异性诱导因子，其经过旁分泌方式分泌后与其受体VEGFR2和VEGFR3结合，使受体磷酸化，通过胞浆内信息传递增加有丝分裂活动，导致内皮细胞增殖和新生淋巴管的形成〔2〕。癌周淋巴管的特点是管壁仅由单层内皮细胞和极薄的结缔组织构成，当受肿瘤侵袭时，其通透性增加、渗液增多，内皮细胞之间连接开放，肿瘤细胞较易进入淋巴管，从而进一步浸润和蔓延。国内外均有文献报道VEGFC在包括肺癌的多种恶性肿瘤如大肠癌、胃癌、前列腺癌和甲状腺癌中高表达，与肿瘤的分化程度、侵袭能力和淋巴结转移密切相关，是预后不良的因素〔3～6〕。本研究采用原位杂交技术，通过地高辛标记的cDNA探针，从基因水平检测VEGFC mRNA在肺鳞癌和腺癌中的表达，其中鳞癌细胞表达阳性率为65.4%，腺癌为59.1%，均处于较高水平，证实VEGFC在肺肿瘤细胞中确有一定程度的高表达，与国内文献报道一致〔7〕。

　　肺癌是最常见和最难治的实体瘤之一，在过去的50年里，肺癌的疗效提高极其缓慢，NSCC有50%～60%的病人不能手术治疗。随着现代分子生物学的不断发展，DNA重组技术和基因转移技术逐步成熟，反义核酸技术是20世纪80年代出现的一种应用反义核酸类药物来抑制特定基因表达的基因治疗技术，其原理是ASODN通过胞吞的方式进入细胞，与细胞内某一特定的基因核苷酸序列互补，与细胞内DNA模版、mRNA模版以碱基配对方式结合，可激活细胞内核糖核酸酶，将其消化破坏，还可通过空间位阻效应干扰mRNA代谢过程中的加帽、剪接、翻译起始、延长等步骤，干扰目的基因的复制、转录和翻译等过程，达到抑制其生物学功能的目的〔8〕。针对治疗某些恶性肿瘤和病毒感染性疾病的ASODN已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验，显示出很好的安全性和有效性〔9〕，其中VEGFC ASODN对恶性间皮细胞瘤有明显抑制作用。在肺癌的基因治疗中，可以设想，鉴于肺癌细胞中的VEGFC的高表达，如果能够下调VEGFC的表达，便可抑制肺癌的经淋巴系转移，从而提高病人的生存率。本实验针对人VEGFC基因编码起始区合成ASODN，通过脂质体介导转染人肺癌细胞株A549，应用Western印迹检测其VEGFC的蛋白表达，发现VEGFC表达明显下降，相对蛋白定量为0.15±0.01，与空白对照组、LIF组和SODN组比较有显著性差异(P<0.01)。结果显示VEGFC ASODN可在体外实验中可下调VEGFC的表达，能够抑制癌周淋巴管的形成，对肺癌的侵袭起负调控作用，因此VEGFC可以作为治疗肺癌的靶基因。

　　本研究结果表明，通过VEGFC ASODN对人肺癌细胞株A549转染，体外应用ASODN能够特异性封闭VEGFC的表达，抑制肺癌细胞的转移，从而为进一步体内实验提供了理论依据。因此利用反义核酸技术的高度特异性开展针对VEGFC的靶向治疗，将可能为肺癌的基因治疗开辟新的途径。

　　【参考文献】

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　　5 Bando H，Weich HA，Horiguchi S，et al.The association between vascular endothelial growth factorC， its corresponding receptor， VEGFR3， and prognosis in primary breast cancer：a study with 193 cases〔J〕.Oncol Rep，2006;1 5(3)：6539.

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　　8 Crooke ST.Potential roles of antisense technology in cancer chemotherapy〔J〕.Oncogene，2000;19(56):66519.

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