不同预充液对处于机械应力下的红细胞的保护作用

作者：胡强,于坤,张燕婉,王红月

作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学阜外心血管病医院,1.体外循环科, 2.病理科, 北京 100037

    【摘要】  目的 比较红细胞处于不同预充液中，受到相同程度机械应力作用时的溶血情况。方法 10个单位浓缩红细胞（200 ml），每袋均分为4份，各50 ml，分别加入50 ml乳酸钠林格氏液（L组）、5%人血白蛋白（A组）、4%琥珀酰明胶注射液（G组）和6%羟乙基淀粉注射液（H组）。混匀后，将其预充于以滚压泵驱动的循环装置上，以1 L/min的流量室温下循环4 h。分别于循环开始时、1 h、2 h、3 h、4 h取血标本2 ml，离心后取上清液，测定游离血红蛋白（Free Hb）和乳酸脱氢酶（LDH）水平，于循环开始和结束时取血标本测定血气、血红蛋白浓度和乳酸脱氢酶（LDH）。红细胞形态学变化采用伊红染色后光镜下观察。结果 4组游离血红蛋白和乳酸脱氢酶水平循环后各时点均较基础值有不同程度升高，差异有显著性（p<0.05）。循环后各时点A组和G组游离血红蛋白和乳酸脱氢酶水平均较其他两组低,4 h差异有显著性(p<0.05)。红细胞形态在A组和G组维持较好。结论 受到机械应力时，人血白蛋白和琥珀酰明胶对红细胞的保护作用较好。

【关键词】  红细胞；溶血；羟乙基淀粉；琥珀酰明胶；白蛋白

　　Protective Effects of Priming Solutions on Erythrocytes Exposed to Mechanical Stress

　　HU Qiang,YU Kun, ZHANG Yan-wan, WANG Hong-yue ,LONG Cun

　　1.Department of Cardiopulmonary Bypass,2.Pathology, Cardiovascular Institute and Fuwai Hospital,CAMS & PUMC,Beijing 100037, China

　　Abstract: OBJECTIVE   To investigate the protective effects of priming solutions on erythrocytes exposed to mechanical stress. METHODS  Free haemoglobin and LDH release from packed red blood cells in 4% fluid succinylated gelatin, 5% albumin solution, 6% hydroxyethyl starch and Sodium Lactate Ringer's Injection was investigated in vitro during circulation with a roller pump from a heart-lung machine for 4 hours at a flow rate of 1.0 L/min at room temperature. RESULTS   Erythrocyte osmotic fragility was similar among all groups. Free haemoglobin and LDH concentrations became progressively higher in every group. 4% fluid succinylated gelatin appears to have potent erythrocyte protective properties similar to those of albumin. CONCLUSION   This effect could decrease mechanical haemolysis during extracorporeal circulation if modified fluid gelatin or albumin solution is used as part of a priming solution.

　　Key words：Erythrocyte;Haemolysis; Hydroxyethyl starch; Succinylated gelatin;  Albumin

　　随着心血管手术的普遍开展，体外循环（Extracorporeal circulation，ECC）技术也越来越多的被各级医院所应用。ECC期间红细胞破坏是不可避免的，红细胞膜很薄，在机械作用或高渗透压下，由于表面张力的影响或压力的突然变化会发生破裂，或因老化发生溶解，从而释放其内容物（主要为血红蛋白），会对机体造成一系列不良影响。

　　通常用血浆中游离血红蛋白（free haemoglobin）的含量表示ECC中的血液破坏程度［1］。血浆游离血红蛋白的正常值是0～5 mg/dl。在活体中，血浆中破坏的游离血红蛋白会被肾脏和网状内皮系统清除。ECC导致的游离血红蛋白浓度中等程度增高时，机体有清除它的能力，正常的网状内皮系统可清除约0.1 mgHb/(kg·min)。当经肾脏滤过血红蛋白的浓度在100 mg/dl以上时，出现血红蛋白尿；当达到300 mg/dl时，可导致肾功能损害。溶血因其与一氧化氮结合会导致血管收缩，还会促进全身炎性反应。引起红细胞损伤的因素很多，包括机械因素和生化因素，血浆蛋白的稀释使红细胞脆性增加，采用晶体和血浆代用品进行血液稀释广泛应用于ECC，本研究旨在探讨一定的机械应力下红细胞在不同预充液中的溶血情况。

1  材料与方法

　　1.1  预充液

　　乳酸钠林格氏液（上海百特医疗用品有限公司）；5%人血白蛋白（上海莱士血制品有限公司）； 4%琥珀酰明胶注射液（血定安，沈阳贝朗医药有限公司）和6%羟乙基淀粉注射液（贺斯，北京费森尤斯卡比有限公司）。

　　1.2  实验方法  　　10个单位浓缩红细胞（200 ml），每袋均分为4份，每份50 ml，分别加入50 ml乳酸钠林格氏液（L组）、5%人血白蛋白（A组）、4%琥珀酰明胶注射液（G组）和6%羟乙基淀粉注射液（H组），混匀，将其预充于一ECC装置，此装置由一个一次性储血袋（山东威高集团有限公司，200 ml）、一段1/4英寸硅胶泵管（北京普惠公司，20 cm）、连接管路（北京普惠公司）组成。采用STOCKERT-Ⅱ型双头泵（STOCKERT公司，德国）。调节泵管松紧度，使泵后连接管内的液面垂直高度于泵头上方75 cm处，调节至液柱每min下降2.5 cm。随机配置两种混合液开始以1 L/min的流量室温下循环4h［2］。将尚未使用红细胞放入冰箱保存，待4 h后，取出配置另两种混合液，再使用同一台双头泵以1L/min的流量室温下循环4 h［2］。

　　1.3  观测指标

　　分别于ECC开始时、1 h、2 h、3 h、4 h取血标本2 ml，离心后取上清液，测定游离血红蛋白（Free Hb）和乳酸脱氢酶（LDH）水平，于ECC开始和结束时取血标本测定血气、血红蛋白浓度。观测ECC结束时即ECC 4 h后的红细胞形态。

　　1.4  检测方法

　　游离血红蛋白用联苯胺显示法测定。乳酸脱氢酶用南京建成生物制品研究所提供的试剂盒检测。红细胞形态学变化采用伊红染色后光镜下观察。

　　1.5  统计学方法

　　利用SPSS 10.0统计软件包进行处理。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用配对t检验，组间比较采用多个独立样本的秩和检验 ，P<0.05为差异显著。

　　2  结  果

　　2.1  悬浮红细胞的平均保存时间（7.6±3.1）d。各组pH值、血红蛋白浓度、游离血红蛋白浓度和乳酸脱氢酶的基础值组间无显著差异(P>0.05)；ECC结束后各组pH值、血红蛋白浓度与基础值比较，无显著性差异；各组游离血红蛋白浓度和乳酸脱氢酶活性在ECC后各时点较基础值明显升高,有显著性差异(P<0.05)；见表1。

　　2.2  组间比较,ECC后各时点G组与A组游离血红蛋白浓度和乳酸脱氢酶活性较其余两组低,在4 h点有显著性差异(P<0.05) ,G组与A组间无显著性差异，见表1。表1  不同预充液ECC前后游离血红蛋白和乳酸脱氢酶的变化（略）注：与基础值比较，*P<0.05;A组与L，H组间比较，#p<0.05;G组与L，H组间比较，△p<0.05

　　2.3  ECC 4 h后红细胞形态A组与G组维持较好，镜下见基本维持了正常的双凹圆盘形,边缘光滑。 其余两组存在较大程度的变形,H组可见出现大量不规则外形红细胞，边缘僵硬，细胞大小不一；L组镜下可见细胞肿胀，边缘模糊，出现大量球形细胞，钝锯齿缘状细胞。见图1、2、3、4。

　　3  讨  论

    本研究旨在比较相同的机械作用下，不同预充液对红细胞的保护作用。将一份浓缩红细胞均分为四份,保证了各组的红细胞寿命,理化特性的一致。

    正常情况下血液在血管内呈流线型流动，血流速度以血管中心部分最快，由于血管内壁对血流的摩擦力，靠近血管内壁血流速度较慢；这种血管中心和边缘部分不同血流速度构成的血流称为“层流”。当ECC中泵头转动时，出现“湍流”或“非流线型”血流。红细胞膜很薄，在机械作用或高渗透压下，由于表面张力的影响或压力的突然变化会发生破裂，或因老化发生溶解，从而释放其内容物（主要为血红蛋白）,即为溶血。红细胞机械损伤源于较高的剪切力对细胞的影响［3］。通常用血浆中游离血红蛋白（Free Hb）的含量表示ECC中的血液破坏程度。血浆游离血红蛋白的正常值是0～5 mg/dl。血浆中游离血红蛋白的水平随ECC时间的延长而升高。ECC结束时血浆游离血红蛋白水平可能最高，因为此时对红细胞机械性损伤的累积量最高。ECC后发生的贫血比ECC中发生的立即溶血更重要：一个红细胞溶解，就有500个红细胞形态功能被改变。灌注后第一个24 h迟发溶血产生的渗血量可能是立即溶血的5倍，这类溶血通过血浆中红细胞大量释放乳酸脱氢酶增高来平衡。故采用游离血红蛋白和乳酸脱氢酶来评价红细胞损伤状况 ［1］。

　检测结果显示红细胞在5%人血白蛋白和4%琥珀酰明胶注射液中,血液破坏程度轻于其余两组。血浆蛋白附着于红细胞表面有助于修复细胞膜的损伤。这种保护作用有赖于带负电的血浆蛋白与红细胞膜的可逆性结合。血浆中起这种作用的主要是白蛋白。在生理pH之下，白蛋白分子表面带有较多的负电荷，使它可依靠静电引力与带正电荷的物质结合。血浆中白蛋白的含量远比球蛋白多，亲水作用又比球蛋白大，这使血浆中的白蛋白对细胞膜起了胶体保护的稳定作用。

    有研究表明，琥珀酰明胶对处于滚压泵碾压产生机械应力作用下的红细胞有明显的保护作用［4］。琥珀酰明胶是一种带负电的多肽物质。琥珀酰明胶组溶血程度低，可能是其与血浆蛋白一样与红细胞膜可逆性结合，从而保护红细胞在机械应力下减少损伤［5］。

    羟乙基淀粉保护作用不佳的原因可能由于羟乙基淀粉是从玉米淀粉合成的高分子量支链淀粉,为电中性分子,不易与红细胞膜结合,也不能够修复损伤的红细胞膜。

    乳酸钠林格氏液为晶体液,而对血液进行无血浆成分的稀释将增加红细胞的机械脆性,造成血细胞的变形。我们的结果也提示红细胞在乳酸钠林格氏液中的机械脆性增加了。形态学观察显示红细胞在琥珀酰明胶和白蛋白组胞膜边缘清晰,无明显肿胀,而另外两组胞膜边缘模糊,细胞肿胀。

    本研究表明白蛋白和琥珀酰明胶可以减轻机械应力对红细胞的破坏，这对临床体外循环工作中合理选择预充液,减少血液破坏有一定的意义。白蛋白价格昂贵，虽然更加接近于生理，但是考虑到费用，与琥珀酰明胶相比，在临床工作中，可能还会更多的选用琥珀酰明胶［6］。

【参考文献】  　　［1］陈彦,王丽,孙鑫 溶血程度的划分及其意义［J］. 现代检验医学杂志,2003,18（5）：64-65.

　　［2］Sumpelmann R, Schurholz T, Marx G et al. Protective effects of plasma replacement fluids on ecythrocytes exposed to mechanical stress［J］. Anaesthesia,2000,55(10):976-979.

　　［3］Paul R, Apel J, Klaus S, Schugner F, Schwindke P, Reul H. Shear stress related blood damage in laminar couette flow［J］. Artif Organs,2003,27(6):517-529.

　　［4］Huskisson L. Intravenous volume replacement: which fluid and why［J］? Archives of Disease in Childhood, 1992,67: 649-653.

　　［5］Kameneva MV,Repko BM,Krasik EF,et al. Polyethylene glycol additives reduce hemolysis in red blood cell suspensions exposed to mechanical stress［J］.ASAIO J,2003,49(5):537-542.

　　［6］Sumpelmann R, Gunther A, Zander R. Gelatine protects erythrocytes against haemolysis caused by mechanical stress［J］. British Journal of Anaesthesia,1999,82:49.