核因子-κB与体外循环全身炎性反应关系的研究

作者:余杨,何德沛,申林,吴洪坤作者单位：重庆市心肺血管研究中心，重庆市中山医院心外科，重庆 400013

   【摘要】  目的 探讨体外循环(ECC)时核因子-κB（NF-κB）与全身炎性细胞因子的变化及关系。方法 选择当地健康杂种犬，常规建立体外循环动物模型。实验组于术前将吡咯二硫氨基甲酸酯（PDTC）20 mg/kg溶解在生理盐水中静脉推注，而对照组仅给予同等剂量的生理盐水。全部实验动物在围体外循环期各时间点分别取相应标本进行NF-κB及血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-6、IL-8的检测。结果 ECC介入后，实验组在各时间点NF-κB基因表达水平及血清炎性细胞因子浓度的增高都明显低于对照组。结论 ECC会引起NF-κB量及血清炎性细胞因子浓度的增加，通过抑制NF-κB能显著减轻ECC术后炎性细胞因子增加的程度。

【关键词】  体外循环；核因子-κB；细胞因子；抗氧化剂

　　The Study of Relationship between Nuclear Factor-κB and Inflammatory Response to Extracorporeal Circulation

　　YU Yang,HE De-pei,SHEN Lin,WU Hong-kun

　　(Department of Cardiosurgery,Zhongshan Hospital,The Research Center of Cardiovasc,Chongqing 400013,China)

　　Abstract: OBJECTIVE   To investigate the changes and relationship of nuclear factor-κB(NF-κB) and inflammatory cytokine in extracorporeal circulation(ECC). METHODS  Routine ECC was established in adult mongrels. Pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC) was administered via vein before operation in experimental group and saline was given in control group. In all animals, the corresponding samples were obtained perioperatively. NF-κB mRNA expression, serum tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)-6、IL-8 were measured respectively. RESULTS  Compared with control group, the increased productions of TNF-α、IL-6、IL-8 and activation of NF-κB were significantly suppressed in experimental group after ECC. CONCLUSION  ECC can induce the increasement of NF-κB mRNA expression and serous cytokine level. Through inhibiting NF-κB activation, it can significantly attenuate inflammatory cytokine after ECC.

　　Key words：  Extracorporeal circulation;Inflammatory Response;Nuclear Factor-κB;Cytokine;Antioxidant

　　体外循环（extracorporeal circulation，ECC）时炎症的触发及其级联反应内部相互作用十分复杂，存在多条不同的炎症通路及复杂的分子网络，通过众多细胞信号转导途径激发炎性反应。目前，国内外众多临床及实验研究均指出核因子-κB(NF-κB)是此过程的核心［1］。故我们在活体狗ECC动物模型上使用其特异性抑制剂-吡咯二硫氨基甲酸酯（PDTC），观察其在围ECC期间对NF-κB激活和炎性细胞因子的影响。

　　1  资料与方法

　　1.1  实验动物及ECC方法  当地健康杂种犬随机分为实验组和对照组（每组6只），体重12～15 kg。按1 ml/kg体重腹腔注射2.5%戊巴比妥钠麻醉［2］，术中麻醉减浅时可按半量静脉推注以维持。静脉给维库溴铵（0.2 mg/kg）诱导插管［3］，接麻醉呼吸机。监测心率、有创动脉压。实验组于术前10 min将PDTC（20 mg/kg）溶解在10 ml生理盐水中静脉推注，而对照组仅给予同等剂量的生理盐水。经左侧肋间进胸，常规建立ECC。两组动物模型平均ECC时间约60 min。

　　1.2  监测指标方法  全部实验动物在ECC开始前30 min、ECC开始后30 min、停ECC后30 min取肺标本行NF-κB mRNA的逆转录聚合酶链式反应检测［4］，并将扩增的目的DNA片段行琼脂糖凝胶电泳，再使用凝胶成像分析仪进行电泳条带的图象分析，计算目的片段的积分光密度值；全部实验动物在ECC开始前30 min，ECC开始后30 min，停ECC后5 min、30 min、60 min、120 min抽取外周静脉血（非抗凝）用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL)-6、IL-8。由于Roth-Isigkeit［5］等通过对比研究发现，在ECC期间血液稀释可能导致低估细胞因子水平。故为去除血液稀释对结果的影响，将上述测得的各细胞因子浓度进行矫正，矫正系数为Hct T1/Hct Tn（Hct T1表示ECC前血标本Hct值；Hct Tn表示各时间点实测血标本Hct值）。

　1.3  统计方法  应用SAS 8.02统计软件进行重复测定的方差分析，所得数据用均数±标准差(±s)表示,结果用F值、P值表示，P＜0.01为有显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  ECC前后NF-κB mRNA表达的比较  本研究观察了两组实验动物ECC前后肺组织NF-κB蛋白因子DNA表达情况，从而间接了解其mRNA表达的变化。ECC前两组肺组织NF-κB mRNA表达差异无显著性（P＞0.01）。ECC后30 min及停机30 min两组肺组织NF-κB mRNA表达均增加，但实验组明显低于对照组，各时间点差异有显著性（P＜0.01）。见表1。

　　2.2  ECC前后炎性介质变化的比较  本研究观察了两组实验动物ECC前后外周血中炎性介质（TNF-α、IL-6、IL-8）浓度的变化。ECC前两组外周血中各炎性介质浓度差异无显著性（P＞0.01）。ECC后30 min、停机5 min、30 min、60 min、120 min两组外周血中各炎性介质浓度均增加，但实验组明显低于对照组，各时间点差异有显著性（P＜0.01）。见表2。

　　表1  ECC前、后两组肺组织NF-κB mRNA表达的变化（略）

　　注：组间比较﹡P﹤0.01，△P﹥0.01

　　表2  ECC前、后两组外周血中炎性介质浓度（Pg/ml）变化（略）

　　注：组间比较﹡P﹤0.01，△P﹥0.01。　　　　3  讨论    　　很早人们就意识到ECC的介入会引起一系列炎性反应，并在一定程度上导致主要器官的损伤，表现在分子水平上就是炎性细胞因子量的增加。NF-κB是一个存在于各种组织细胞中的因子，在正常情况下与其抑制因子（IκB）结合，以非活性状态存在于胞浆中。ECC的介入可激活NF-κB，使其与IκB解体，进入细胞核，从而在转录水平上调控炎症网络分子的表达，改变炎性细胞炎性反应性及基因对体外的炎性刺激的应答性，是炎性介质的合成及其瀑布式级联反应信号传导通路的中心环节，广泛调控着炎性反应、应激反应和免疫反应相关基因的表达。    　　同时，NF-κB是一种氧敏感转录因子，细胞内外源性刺激主要是通过氧自由基增加刺激第二信号系统而激活它。作为强抗氧化剂的PDTC［ 6］可以提高细胞内谷胱苷肽的含量，调节细胞的氧化还原状态及活性氧介质（reactive oxygen species，ROS），阻止IκB磷酸化，从而抑制NF-κB表达和激活，最终导致ECC术后炎性细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的减少。    　　本实验结果表明，对照组在ECC介入后NF-κB自身mRNA表达显著增加，血清三种炎性细胞因子浓度明显增高。而使用PDTC的实验组，结果显示，NF-κB自身mRNA表达及血清炎性细胞因子浓度明显降低。    　　总之，核转录因子的激活在ECC炎性反应损伤中起着重要作用，抑制其激活有益于术后炎性的减轻。

【参考文献】  　　［1］ Nakamori Y,Koh T,Ogura H,et al.Enhanced expression of intranuclear NF-kappa B in primed polymorphonuclear leukocytes in systemic inflammatory response syndrome patients［J］.J Trauma,2003,54(2):253-260.

　　［2］ 王元占，杨培梁，刘秋菊，等.常用实验动物的麻醉剂［J］.中国比较医学杂志，2004，14:245-247.

　　［3］ 陆群芳.犬的气管插管全身麻醉［J］.上海实验动物科学，2002，22:62-63.

　　［4］ 萨姆布鲁克，拉塞尔.分子克隆实验指南［M］. 黄培堂译.北京:科学出版社，2002.8.

　　［5］ Roth-Isigkeit A,Borstel TV,Seyfarth M,et al.Perioperative serum levels of tumour-necrosis-factor alpha(TNF-alpha),IL-1beta,IL-6,IL-10 and soluble IL-2 receptor in patients undergoing cardiac surgery with cardiopulmonary bypass without and with correction for haemodilution［J］.Clin Exp Immunol,1999,118(2):242-246.

　［6］ Schiekofer S,Rudofsky G Jr,Andrassy M,et al.Glimepiride reduces mononuclear activation of the redox-sensitive transcription factor nuclear factor-kappa B［J］.Diabetes Obes Metab,2003,5(4):251-261