磷酸化p38在非小细胞肺癌中表达的意义

    作者：王志强    作者单位：214062 江苏无锡市第四人民医院胸心外科     【摘要】  目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶p38在非小细胞肺癌组织中的表达与活性，以及它与肺癌临床病理特征之间的相关性。 方法 应用固定化蛋白质印迹法检测52例非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中p38和磷酸化p38（Pp38）的表达情况;免疫组织化学法分析其在细胞内的定位。 结果 肺癌组织中p38的表达水平与癌旁正常组织无明显差别（P>0.05）;而所有癌组织标本中Pp38的表达水平全部增高，为癌旁组织的2.1倍（P<0.01）; Pp38的表达在鳞癌、腺癌组织中无明显差异，与肺癌肿瘤直径大小、淋巴结转移及TNM分期无关。免疫组织化学显示p38分布在胞浆内，而Pp38在胞浆和胞核内均有表达。 结论 p38的过度激活可能在肺癌的发生、发展过程中起着重要作用。

    【关键词】  肺癌 p38 固定化蛋白质印迹 免疫组织化学

    丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases/ MAPKs）信号转导通路是细胞内重要的信号转导系统，在将胞外刺激信号转导至细胞及其核内、介导细胞生物学反应（如增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有重要的作用。本研究旨在通过检测p38蛋白的表达及其活性，来探讨它们在肺癌的发生、发展中的意义。

    1   资料和方法

    1.1   临床资料

    连续收集我院2005年6月～ 2006年1月肺癌根治术切除的标本52例，其中男性29例，女性23例，中位年龄52岁（36～ 70岁）。采取1997年国际抗癌联盟肺癌病理分期标准分为：Ⅰ期14例，Ⅱ期7例，Ⅲ期28例，Ⅳ期3例；鳞癌27例，腺癌23例，大细胞癌2例。所有标本均经病理证实。每例标本取癌组织及癌旁正常组织（距肿瘤边缘>5cm），在手术切除标本后30min内，立即冻存于液氮中。

    1.2   主要试剂及方法

    应用RIPA组织裂解液分别裂解肺癌与正常肺组织，提取组织总蛋白；蛋白定量试剂盒（美国BioRad公司产品）测定组织提取液的蛋白浓度。每例标本取蛋白50 μg电泳，经10%聚丙烯凝胶电泳分离后电转移至PVDF膜（美国Millipore公司）上，封闭后，加一抗（兔抗人p38及Pp38多克隆抗体，美国Santa  Cruz公司，工作浓度1∶1 000）和二抗（辣根过氧化物酶结合羊抗兔多克隆抗体，英国Amersham公司产品，工作浓度1∶1 000）进行杂交。ECL化学发光试剂盒（英国Amersham公司产品）检测杂交信号，发光显影于感光胶片上。

    肺癌石蜡包埋标本制成5μm厚的切片，脱蜡水化后，3%H2O2灭活内源性酶。然后分别与一抗（兔抗人p38及Pp38多克隆抗体，工作浓度1∶1 000）、二抗（生物素标记羊抗兔IgG,1∶400稀释）及辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素复合物（1∶400稀释）孵育。DAB显色，苏木素复染，封片观察。

    HPIAS 2000型图像分析软件测定条带的OD值，以OD值代表p38及Pp38蛋白的相对表达量。计算每一例标本中肿瘤与正常肺组织OD值的比值，以此值反映各病例之间p38及Pp38蛋白表达水平的差异。

    1.3   统计学方法

    应用SPSS11.0统计软件，进行样本t检验。

    2   结果

    27例（51.9％）肺癌组织标本中p38蛋白的表达水平高于癌旁正常组织，差异无统计学意义。Pp38蛋白表达水平在52例标本中全部高于癌旁正常组织，为癌旁组织的2.1倍,P<0.01差异有统计学意义，见表1、图1。表1   p38和Pp38在非小细胞肺癌中的表达情况 Pp38蛋白表达水平与肺癌的分型、肿瘤直径、淋巴结转移及TNM分期均无关，见表2。

    免疫组化结果：p38蛋白分布在胞浆内，见图2a；Pp38蛋白在肺癌和正常肺组织胞浆和胞核内均有表达，见图2b，肺癌组织染色较深，正常组织染色较浅，癌组织与正常组织染色无明显差异。表2   Pp38的表达与人非小细胞肺癌的临床病理特征的关系

    3   讨论

    大量研究已证实哺乳动物内至少存在四条MAPK通路，MAPK信号蛋白的表达异常可通过级联反应引发该通路失调，从而介导细胞恶变。p38是 1993年Brester等人发现的，通过磷酸化而被激活。

    研究表明p38信号传导途径在乳腺癌侵袭与转移中起关键作用，其蛋白表达与乳腺癌临床分期有关[1]。大肠癌组织中p38蛋白处于过度表达状态，并且与大肠癌的发生、发展和转移密切相关[2]。此外，亦有研究报道p38蛋白与肝癌、食管癌、胃癌等相关。

    大量研究表明MAPK激酶在肿瘤组织中过度表达，但本研究结果中全部癌组织标本高于正常组织的情况未见报道。由此可见，Pp38的表达水平和肺癌密切相关，p38通路与肺癌的关系更值得进一步的研究。

    根据本研究免疫组化结果，我们猜测p38作为一种蛋白激酶广泛存在于细胞胞浆内，在紫外线、高渗、应激及细胞因子等影响下激活MAPK通路,p38活化转化为Pp38移位于核内作用于相应的转录因子，启动基因转录，从而参与肺癌的形成和发展。p38在肺癌中的作用机制尚不清楚， Greenberg等人[3]模仿肿瘤组织的低氧环境，将非小细胞肺癌A549细胞放在体外低氧的温箱里培养，却发现Pp38并没有随着时间的延长而增加。这表明仅仅低氧环境尚不能激活p38蛋白，p38通路的活化是一个复杂的过程，其具体机制有待进一步研究。

    本结果表明Pp38蛋白表达水平在鳞癌、腺癌组织中无明显差异，与肺癌淋巴结转移、肿瘤直径大小及TNM分期无关。因此，我们认为p38通路的过度激活在肺癌的发生过程中起着重要作用，似乎和进一步恶化关系不大。这为肺癌的预防提供了一个新的方向。p38抑制剂的开发研究已经表现出广阔的前景。p38特异性抑制剂可抑制JAR细胞的侵袭能力[4]。VEGF通过p38通路诱导肝癌细胞转移，而阻断p38通路可抑制这种转移[5]。

    p38信号蛋白的过度激活与肺癌的发生密切相关。p38蛋白及其信号通路的进一步研究有望为非小细胞肺癌的发病机制提供新的思路。 

【参考文献】[1] 李柏林，韩硕，李凤，等.p38信号蛋白在乳腺癌组织中表达的研究[J].中国老年学杂志，2006，3（26）：346349.

[2] 孙泽群，徐少勇，邓长生，等.p38蛋白在大肠癌中的表达及其临床意义[J].中国肿瘤临床，2005，32（11）：635637.

[3] Greenberg AK,Basu S,Hu J,et al.Selective p38 activation in human nonsmall cell lung cancer[J].Am J Resp Cell Mol Biol,2002,26(3): 558564.

[4] Zhang XQ,Pang ZJ,Chen SL,et al. p38 MAPK inhibitor SB203580 in inhibition of in vitro invision human choriocarcinoma JAR cells[J]. J Prac Oncol,2003,18(2):9597.

[5] Mao H,Yuan AL,Zhao MF,et al.The effect of signal passway of mitogen activated protein kinase on hepatocellular carcinoma metastasis induced by VEGF [J].Chin J Dig,2002,20(1):1416.