归脾丸对苯中毒小鼠骨髓细胞周期的影响

苯(benzene)与现代人的生活、工作密切相关。长期吸人苯系物而出现的表现主要有:初期时齿跟和鼻豁膜处有类似坏血病的出血症，并出现神经衰弱样的症状，如头昏、失眠、乏力、记忆力减退、思维及判断力降低等;随后出现白细胞减少和血小板减少，严重时可使骨髓造血功能发生障碍，导致再生障碍性贫血。目前对苯中毒所致的白细胞减少，常以输注成分血白细胞、口服西药制剂如鳖肝醇、利血生等和应用粒细胞集落刺激因子(GCSF)等为主。但输注成分血白细胞受到血源等限制，口服升白药物疗效不佳，而应用GCSF虽见效快，但维持时间短且价格昂贵。故研制出一种疗效佳、价格便宜的药物治疗苯及混苯作业所致血细胞减少症成为当前较为紧迫的任务。笔者前期已证实归脾丸能改善苯中毒后造血指标川，但对其改善造血功能的机制尚不清楚，故本研究从骨髓造血细胞周期方面研究归脾丸对苯中毒小鼠骨髓抑制的影响，初步探讨其恢复机体造血功能的可能机制。

材料与方法

1动物8一12周龄昆明小鼠72只，体重 X20士2g，雌雄各半，由甘肃中医学院动物实验中心提供。实验动物质量合格证号:SCXK(甘)2004- 0006。全部实验在甘肃中医学院SPF实验室完成。经35天喂养后各组小鼠体重均增加2一3g，但组间比较，差异无统金卜学意义(P > 0. 05)。

2药物、试剂及仪器浓缩归脾丸(由党参、炒白术、蜜炙黄EE、蜜炙甘草、获荃、制远志、炒酸枣仁、龙眼肉、当归、木香、大枣共11味药组成)，批号:200937，兰州佛慈制药厂生产，每8粒相当于原生药3g。取浓缩丸10 g (55粒)溶于65 m L纯净水，用纯净水连续加倍稀释2次。利血生，批号:20091104，江苏吉贝尔药业有限公司生产。鳖肝醇，批号:20080511，广东康奇力药业有限公司生产。PBS缓冲液，碘化丙陡染液(美国 Sigma)，流式细胞仪(Becton Dickinson FACscan, 美国Bekman公司);CD1200血细胞全自动分析仪 (美国);自制木箱，40 cm x 40 cm x 40 cm，周壁黑色，底部等分为25方格。

3分组和造模72只小鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、西药组以及归脾丸大、中、小剂量组6组，每组12只。参考文献[5-8]方法造模，除正常对照组外，其余5组均每天8h置于人工模拟高苯浓度(苯浓度2 000 mg/m3)环境下，连续14天。并于实验第14天将各组小鼠断尾采血，用CD1200 血细胞全自动分析仪检测小鼠外周血白细胞、血小板和血红蛋白计数，观察苯中毒造模情况。根据文献 [9]相关标准:苯接触作业者连续2次白细胞计数< 4. 5 x 10g/L为白细胞减少(轻度苯中毒)，伴有血小板计数<80 x 1g/L或血红蛋白<110 g/L(女性)、 120 g/L(男性)为中度苯中毒。

4给药方法各组均于造模成功后第2天开始给药。归脾丸大、中、小剂量组分别给予归脾丸溶液 8,4,2 mg/(kg /d)灌胃，分别相当于临床成人用量的20 ,10 ,5倍;西药组给予利血生1.5 mg/(kg/d) , 鳖肝醇5 m g(kg/d)，配成混悬液灌胃;正常对照组和模型组每天以生理盐水0.2 m L/只灌胃;均每天 1次，连续3周。给药期间为防小鼠自愈，除正常对照组外其余各组继续高苯环境喂养。

5骨髓有核细胞悬液的制备及计数末次给药 24 h后，以颈椎脱臼法处死各组小鼠，取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两端，用6号针头以1 mL 生理盐水冲出骨髓细胞，4号针头过滤成单个骨髓细胞悬液，取部分骨髓细胞悬液在流式细胞仪下按 3 min细胞数进行骨髓有核细胞计数。

6细胞周期样品制备将上述单个骨髓细胞悬液离心，1 000 r/min ,5 min，弃上清液，用PBS洗涤2 次，去大部分上清液，留少许生理盐水将细胞混匀，再将细胞滴人70%冷乙醇内固定，立即混匀，放置4 0C 冰箱过夜备用。

7细胞周期分析取上述70%冷乙醇固定的细胞样品，用PBS洗2次，以洗去残留的乙醇，留少许 PBS混匀细胞，加人碘化丙陡染液，放人4℃冰箱避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果以细胞周期各时相细胞百分率表示，并计算细胞增殖指数(proliferation index , PI).公式:PI(%)=(S+ G2 /M)/(Go /G,+S+G2/M)x 100%。

8统计学方法应用SPSS 17. 0软件进行统计学分析，实验数据以X士S表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD检验，p<0. 05为差异有统计学意义。

结果

1造模情况(表1)实验过程中无动物死亡及脱失。经14天模拟高浓度苯吸人后，12只染毒小鼠的3项外周血指标均明显下降，达到苯中毒诊断标准。其中达轻度苯中毒标准者4只;达中度苯中毒标准者8只。

2各组小鼠骨髓有核细胞计数比较(表2,}a侧与正常对照组比较，模型组骨髓有核细胞计数明显减差异有统计学意义(p< 0. 05 )。与模型组比较，归脾丸大、小剂量组及西药组骨髓有核细胞计数均明显增加，差异有统计学意义(p< 0. 01 )。归脾丸中剂量组骨髓有核细胞计数明显少于西药组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。

3各组小鼠骨髓细胞周期比较(表2)与正常对照组比较，模型组S期细胞比例和PI增加，Go/G1 期细胞比例下降，差异均有统计学意义(p<0.05); Gz /M期细胞比例亦下降，但差异无统计学意义(P> 0. 05 )。与模型组比较，归脾丸大剂量组Go/G。期细胞比例下降，G2 /M期细胞比例和增加，差异均有统计学意义(P < 0. 01 );归脾丸中剂量组S期细胞比例下降，差异有统计学意义(p<0. 05 )。与西药组比较，归脾丸大剂量组在G2 /M期细胞比例和PI增加而在 Go /G。期细胞比例下降，差异均有统计学意义(p< 0. 01 );归脾丸中剂量组在Go /G，期细胞比例增加而在S期细胞比例和PI下降，差异均有统计学意义(P<0. 05)。

讨论

苯被广泛应用于工业生产和日常生活中，慢性苯中毒的报告呈上升趋势二实验研究证明苯中毒可导致记忆功能和造血功能同时下降;归脾丸溶液可改善苯中毒所致的记忆力减退及判断力降低的神经衰弱症状，提高学习记忆能力[11]。骨髓是慢性苯中毒的主要靶器官，长期吸人苯系物的人可患各种血液系统疾病。 根据中医学理论，心主血，脾生血，脾气足则血有生化之源，而心血充盈。《灵枢·决气》:“中焦受气取汁，变化而赤，是谓血。”可见中焦脾胃运化的水谷精微是血液生化之源。 归脾丸为归脾汤的浓缩丸剂，原方归脾汤出自宋代严永和的《济生方》，具有补气养血、健脾养心之功，主治气血两虚或心脾两虚所致的食少倦怠、心悸怔忡、健忘失眠等症。现代药理研究发现，党参主要化学成分为多糖、多种氨基酸、多种无机元素等，张天红等 研究发现，党参的醇、水浸液可使小鼠血红蛋白及红细胞增加，皮下注射可使白细胞和网织红细胞显著增加。白术主要化学成分为挥发油和多糖，而挥发油主要成分为苍术酮、苍术醇等，从白术中分离得到的内醋类成分有白术内醋Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅲ双白术内醋等。有研究将不同种炮制白术中内醋Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ的含量进行比较，发现炒白术后其内醋Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ的含量明显高于生品[13-15]。李伟等[16]在对白术内醋Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ的活性研究中发现白术内醋工为白术健脾的主要有效成分。获荃的主要化学成分为获荃多糖和获荃素等，获荃多糖在一定程度上加快造血机能的恢复，并可改善老年人的免疫功能，增强体质，保护骨髓等，达到扶正固本、健脾补中的作用[7]。黄茂的化学成分主要有黄酮类、皂昔类和多糖等，黄茂多糖可全面持续升高全血细胞及促进造血细胞因子的分泌，从而激发造血系统的功能。当归的有效成分主要是苯酞类、香豆素类、阿魏酸纳、黄酮类、挥发油和多糖等，当归多糖能提高造血功能。远志的主要化学成分为皂昔类、糖及糖昔类、生物碱等，李光植等研究发现远志水煎剂可使衰老小鼠红细胞的超氧化物歧化酶、肝组织谷胧甘肤过氧化物酶的活性明显升高。

综上，现代药理研究结果也进一步证明归脾丸的主要药物对造血功能有一定影响。 本实验根据中医基础理论结合现代研究手段，采用静式吸人染毒法以模拟人的中毒环境，即高苯浓度环境下小鼠被连续喂养，4天后，白细胞计数<4. 5 x 109/L，达到国家苯中毒诊断标准为模型，从细胞周期角度初步探讨归脾丸对造血功能影响的可能机制。 细胞周期是1个细胞经过一系列生化事件而复制它的组分，然后一分为二。传统上，真核细胞周期被分为连续的4个时期:G1,S,G:和M期。其中有2个主要检查点，第一，G:检查点:存在于G:晚期，一些促进或抑制细胞增殖的信号通常是通过调节G:期的检测点而实现的;第二，G2或G2/M检查点。本实验采用流式细胞术对骨髓细胞周期进行分析，结果表明一方面慢性苯中毒可能更多地影响细胞周期的检查点中的G:或G2/M，使细胞不能正常进行有丝分裂，而使骨髓受到抑制;另一方面归脾丸能促进处于Go/G1 期骨髓细胞进人细胞周期，G2/M期细胞比例增加，PI 提高，尤其是归脾丸大剂量组，表明剂量在一定程度上影响了归脾丸的治疗效果。此外，模型组与正常对照组比较，苯亦能使骨髓细胞PI增加，不排除外周血细胞减少反馈性调节骨髓细胞分裂的可能。 一般而言，在一定的剂量范围内，药物的疗效随着剂量的增加而增加，而在本实验结果中，归脾丸大、小剂量组骨髓有核细胞计数均明显增加;归脾丸中剂量组无明显变化，并且在细胞周期中，PI亦低于归脾丸大、小剂量组，与常规不符。在药量与疗效的相关性中，药量不同，功效不同，就本实验来讲，给药时间和剂量是2个主要的差异因素，其中起决定作用的是药量的不同，那么是否存在药物的剂量不同，使得药物作用部位或靶点不同呢?笔者查阅相关文献后发现，在单味中药中存在药量不同致功效不同的情况。如红花，朱丹溪言“多用则破血，少用养血”。山碴6g祛疲力强;9-12g温通力强，用于治疗慢性肝炎;10- 30 g治疗慢性胆囊炎、萎缩性胃炎。对于复方剂量的研究，主要有复方整方剂量的变化和方中药物剂量(或药味)的变化两种情况，但目前对前者的研究较少。周俊[23]认为中药复方有多个作用靶点，并认为用“拆方法”研究复方的结果似不能说明复方的复杂作用机理。郝海平等[24]认为 “多靶点、低亲和力、低选择性”药物研发模式将可能 成为未来全球创新药物研发的主体，并取代“单靶点、高亲和力、高选择性”。

因本实验是小样本实验，还无充足的证据来论证药物的剂量与药物作用部位或靶点的关系，有待进一步的实验进行探讨。 综上所述，本实验提示归脾丸可通过促进受苯损伤的骨髓细胞进人细胞周期，促进骨髓造血细胞增殖，从而提高外周血象的恢复。

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