外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响

　　作者：徐爱华 柳忠兰 作者单位：中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 沈阳 110001

　　【摘要】 目的 研究外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响。方法 将40只大鼠随机平均分为正常对照组、长期大量吸烟组(燃烧香烟10支×2次/d，共90 d)、短期大量吸烟组(燃烧香烟10支×2次/d，共45 d)、吸烟+bFGF组(燃烧香烟10支×2次/d，共90 d,吸烟最后15 d经腹腔内注射bFGF 200 μg/ml)，每组10只。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL法)及免疫组化法检测细胞凋亡和p53蛋白表达。结果 各吸烟组脑细胞凋亡及p53蛋白表达较对照组明显增加(P<0.01)，凋亡细胞数量和p53蛋白表达强度随吸烟时间和剂量增加而增加。bFGF治疗组大鼠脑细胞凋亡数及p53蛋白表达较单纯吸烟组明显减少(P<0.01)。结论 吸烟可使大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达增加，细胞凋亡及p53蛋白表达强度与吸烟时间及数量相关，bFGF 通过抑制p53表达减少细胞凋亡。

　　【关键词】 外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);吸烟;凋亡;p53

　　基金项目：卫生部科学研究基金资助项目(981196)，辽宁省自然科学基金资助项目(9810500303)

　　近年研究发现，吸烟或烟雾暴露可诱导脑细胞发生凋亡。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种神经营养因子，其神经活性广泛，能保护神经元，促进神经生长，具有抗缺血性脑损伤的作用。目前国内外尚无关于外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡影响的报道。本研究将外源性bFGF应用于吸烟大鼠，通过对大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达进行分析，探讨外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡的作用及其机制，进一步为临床应用bFGF提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 健康成年雄性Wistar大鼠40只(由中国医科大学实验动物中心提供)，体重200～250 g，随机分为正常对照组、长期大量吸烟组、短期大量吸烟组、长期大量吸烟+bFGF组，每组10只。饲养室内温度、湿度保持恒定，自然光照，自然通风，大鼠可自由接触食水。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂 bFGF购自北京白鹭源生物技术责任有限公司。p53抗体、SABC免疫组化试剂盒、凋亡试剂盒均购自武汉博士的生物制品实验有限公司。尼古丁来自含量为1.5 mg/支的市售某品牌香烟。

　　1.2.2 模型制备 将各吸烟组大鼠置于80 cm×60 cm×40 cm的自制烟熏箱中，实验期间各组大鼠饲养条件一致。长期大量吸烟组燃烧香烟10支×2次/d，共90 d;短期大量吸烟组燃烧香烟10支×2次/d，共45 d;长期大量吸烟+bFGF组燃烧香烟10支×2次/d，共45 d，并于吸烟最后15 d腹腔内注射bFGF 200 μg/ml,按135 μg·kg-1·w-1经腹腔内注射给药，每日2次，连续15 d。

　　1.2.3 检测指标 细胞凋亡:切片依次经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K 20 μg/ml 37℃消化15 min，TBS(pH 7.4)洗5 min，3次。滴加TUNEL反应液(TdT 1 μl，DIGdUTP 1 μl，18 μl标记缓冲液，20 μl/片)，37℃孵育2 h。TBS洗2 min，3次，加生物素化地高辛抗体，37℃孵育30 min，TBS洗2 min，3次，DAB显色，苏木素复染。树胶封片。阴性对照TUNEL反应液中去掉TdT酶，其余操作同上。免疫组化染色:切片常规脱蜡入水,0.3%过氧化氢37℃作用10 min灭活内源性酶。0.01 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)高压修复2 min左右，冷却至室温，滴加5%BSA封闭液37℃，20 min。加p53抗体，4℃过夜。PBS洗5 min，3次，加生物素化羊抗兔IgG 37℃孵育20 min，PBS洗2 min，3次。滴加SABC 37℃，20 min。PBS洗3 min，5次。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余操作同上。

　　1.3 统计学处理 用显微成像系统采集图片，计算并分析阳性细胞平均灰度值，数据用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，各组间比较用两样本均数比较的t检验。

　　2 结果

　　2.1 大鼠脑细胞凋亡 凋亡细胞TUNEL阳性染色为褐色圆形或椭圆形实心小体,正常对照组偶有散在的凋亡细胞。各吸烟组与正常对照组相比凋亡细胞明显增多(P<0.01)。长期大量吸烟组凋亡细胞较短期大量吸烟组明显增多(P<0.01)。bFGF治疗组凋亡细胞较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多(P<0.01)。凋亡细胞分布以海马区最多，皮质及其他脑区亦可见分布。见表1。

　　2.2 p53蛋白表达 光镜下可见核为蓝色、胞浆为棕色的p53阳性细胞。正常对照组有少量阳性表达，各吸烟组p53阳性细胞较正常对照组明显增多(P<0.01)。长期大量吸烟组p53表达较短期大量吸烟组明显增多(P<0.01)。bFGF治疗组p53表达较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多(P<0.01)。p53阳性细胞分布以海马区最多，皮质及其他脑区亦可见分布，与凋亡细胞分布一致。见表1。

　　表1 吸烟大鼠脑内凋亡细胞及p53阳性细胞平均灰度(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.01;与长期大量吸烟组比较：2)P<0.01

　　3 讨论

　　凋亡是细胞接受某种信号或受到某种因素刺激后的一种主动的、由一些相关基因相互作用、以细胞DNA早期降解为特征的细胞自杀过程。在一些因素刺激下，神经细胞可发生病理性凋亡，被认为与多种神经系统疾病如神经变性病、老年痴呆和缺血性脑损伤等有关。吸烟是缺血性脑血管病重要的可干预危险因素之一,吸烟或烟雾暴露已被证明可诱导多种组织细胞发生凋亡〔1，2〕，也可诱导脑细胞发生凋亡〔3〕。本实验结果显示，正常大鼠脑组织内仅有个别散在的凋亡细胞，而各吸烟组脑组织凋亡细胞明显增加，并且与吸烟时间和数量呈正相关。

　　p53基因是一种促凋亡基因，基因有野生型和突变型两种，正常存在于细胞内的p53基因为野生型。实验发现野生型P53表达增加能活化其他促凋亡基因的转录,使细胞进入凋亡过程,细胞的凋亡数与野生型p53基因拷贝数呈正相关〔4〕，有人认为野生型p53可能起着启动细胞死亡程序的作用〔5〕。p53同时也是缺血损伤时敏感而可靠的标志，缺血缺氧、DNA损害均能刺激p53基因表达明显增加，导致野生型蛋白聚集，从而诱导细胞凋亡。本研究表明，各吸烟组大鼠脑内p53蛋白表达较正常对照组明显增加，与吸烟时间和数量呈正相关，并且与凋亡细胞分布一致。

　　bFGF是一种具有多种生物学活性的多肽，正常情况下脑内只有轻度的bFGF表达，但在大脑发育期、损伤或中风发生时表达水平上调〔6〕。用放射性标记的bFGF检测发现，在正常情况下外源性bFGF不能通过血脑屏障，而当脑组织受到各种损伤时，bFGF则能通过受损的血脑屏障发挥其神经保护作用〔7〕。本实验发现吸烟后腹腔内注射bFGF大鼠的脑细胞凋亡数较单纯吸烟大鼠均明显减少，促凋亡基因p53表达也明显降低降低，说明吸烟导致血脑屏障受损，外源性bFGF通过受损的血脑屏障对吸烟引起的脑组织损伤发挥一定的保护作用。bFGF的脑保护作用可能通过多种途径实现：(1)bFGF可增加两种重要的抗氧化酶Cu/Zn过氧化物歧化酶和谷胱还原酶的活性来对抗缺血后的谷氨酸兴奋毒性损伤〔8〕;(2)bFGF能抑制海马神经元内一种71 kDa NMDA受体相关蛋白表达〔9〕，对抗NMDA的神经毒性，近来研究还表明bFGF能增加NMDA受体拮抗剂(MK801)的抗缺血后神经损害作用〔10〕;(3)细胞内Ca2+超载是缺血性脑损伤的关键因素，bFGF能维持细胞内Ca2+内环境稳定，阻止Ca2+内流〔11〕;(4)bFGF还有降低NO神经毒性的作用〔12〕;(5)bFGF直接营养胶质细胞、血管和神经元，可作为胶质营养因子促进胶质细胞分化，又可作为血管源性因子促进脑血管内皮细胞及血管增生，以抵抗缺血的损伤。

　　【参考文献】

　　1 Hoshino Y，Mio T，Nagai S,et al.Cytotoxic effects of cigarette smoke extract on alveolar type II cellderived cell line〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001;281(2):50916.

　　2 Wang H，Ma L，Li Y,et al.Exposure to cigarette smoke increases apoptosis in the rat gastric mucosa through a reactive oxygen speciesmediated and p53independent pathway〔J〕.Free Radic Biol Med，2000;28(7):112531.

　　3 李 华，柳忠兰，薛喜峰.吸烟大鼠脑细胞凋亡与蛋白表达〔J〕.中风与神经疾病杂志，2003;3：2168.

　　4 Colombel M，Olsson CA，Ng PY,et al.Hormoneregulated apoptosis results from reentry of differentiated prostate cells onto a defective cell cycle〔J〕.Cancer Res，1992，52(16):43138.

　　5 Gavrieli Y，Sherman B，Sasson SA,et al.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation〔J〕.J Cell Biol，1992;119(3):493501.

　　6 Barid A.Fibroblast growth factors：activities and significance of nonneurotrophin neurotrophic growth factors〔J〕.Curr Opin Neurobiol，1994;14:78.

　　7 Cuevas P，Carceller F，Gimenez G,et al.Fibroblast growth factors and cerebral ischemia〔J〕.Neurol Res，1994;16:181.

　　8 Hui WM，Joana H，Chen B,et al.Nicotine induced gastric injury a quantitative macroscopic and microscopic analysis of the protective effects of sucralfate and feeding〔J〕.Gut，1991;32(4)：3726.

　　9 Mattson MP，Kumar KN，Wang H,et al.Basic FGF regulateds the expression of a functional 71Kda NMDA receptor protein that mediates calcium influx and neurotoxicity in hippocampal neurons〔J〕.J Neurosci，1993;13(11):457588.

　　10 Barth A，Barth L，Morrison RS，et al.bFGF enchances the protetive effects MK801 against ischemic neuronal injury in vitro〔J〕. Neuroreport，1996;7:1461.

　　11 Mark P，Mttson P，BIN C，et al.Growth factors protect neurons against excitotoxic/ischemic damages by stabilizing calcium homeostasis〔J〕. Storke，1993;12:136.

　　12 Maiese K，Boniece I，Demeo D，et al.Fibroblast growth factors protect agaist ischemia in culture by preventing nitric oxide toxicity〔J〕. Neurosicence，1993;13(7):3034.