氧化修饰蛋白质在帕金森病发病机制中的作用

　　作者：张颖 杨艺敏 白晶 常明 许志军 胡林森 作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 从氧化修饰蛋白质的角度探讨帕金森病(PD)的发病机制。方法 本实验分为实验组(PD细胞模型组) 和对照组。PC12细胞孵育24 h后，实验组加入以DMSO溶解的终浓度10 μmol/L的蛋白酶体抑制剂(PSI)，对照组加入DMSO，继续孵育24 h后进行观察。MTT法检测细胞存活率，HE染色观察细胞内包涵体的形成。采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western 印迹技术相结合的方法在PD细胞模型中筛选氧化修饰的蛋白质。结果 对照组不存在而实验组存在的氧化蛋白点有8个，其中有1个被质谱鉴定出来，为β微管蛋白(βtubulin)。结论 氧化修饰的βtubulin为探讨PD的发病机制及治疗药物的研发提供有价值的线索。

　　【关键词】 帕金森病;发病机制;氧化修饰;蛋白质组学;细胞骨架蛋白

　　帕金森病(PD)是一种老年人常见的神经系统变性疾病，其病因和发病机制涉及线粒体功能紊乱、兴奋毒性、炎症、氧化应激损害等多种因素。由于脑组织自身特点使其更易受到氧化应激损害〔1〕，而蛋白质的氧化修饰则是发生氧化应激的标志之一。近年来国外研究者们采用蛋白质组学方法研究氧化修饰蛋白质在神经系统变性疾病中的作用，但多集中在阿尔茨海默病(AD)〔2〕，在PD中的研究较少。本实验首先通过2，4二硝基苯肼(DNP)的衍生步骤标记含有羰基的氧化蛋白质，而后采用双向电泳、质谱鉴定与蛋白质羰基免疫印迹检测相结合的方法，期望发现与PD相关的氧化蛋白质，进而为探讨PD的发病机制及治疗药物的研发提供有价值的线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器

　　肾上腺素嗜铬细胞瘤(PC12)细胞购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基购自Gibco公司。新生牛血清由杭州四季青生物制品厂生产。荧光倒置相差显微镜为日本Olympus产品。DNP购自东京化成工业株式会社，一抗购自Molecular Probe公司，二抗、显色液等购自Sigma公司。硝纤膜、试剂盒、固相pH值梯度(IPG)胶条等均购自Amersham Biosciences公司。聚焦仪、电泳系统、凝胶图像扫描仪、2D Evolution分析软件和质谱仪为Amersham Biosciences公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PD细胞模型的建立

　　PC12细胞复苏后，以2×105/ml的密度接种于底面积25 cm2的塑料培养瓶，于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。2～3 d更换1次培养液。选取对数生长期细胞进行传代。细胞以1×105/ml密度接种于底面积25 cm2的培养瓶。24 h后更换培养液，实验组加入终浓度10 μmol/L的蛋白酶体抑制剂(PSI)，以二甲基亚砜(DMSO)溶解，对照组加入DMSO，DMSO终浓度均为0.1%，继续孵育24 h后收集两组细胞用于实验。噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;苏木素伊红(HE)染色观察细胞内包涵体的形成。

　　1.2.2 提取细胞总蛋白

　　倾去培养液，以冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，计算细胞重量。按重量比1∶10加入裂解液，室温作用1 h。25 000 r/min，离心30 min，收集上清。应用Cleanup试剂盒去除杂质，二维度(2D)定量试剂盒进行蛋白质定量(浓度控制在5～10 mg/ml)。

　　1.2.3 一向等电聚焦电泳及DNP衍生

　　240 μg样品与一向电泳缓冲液混合后均匀加入胶条槽，IPG胶条胶面朝下放入胶条槽，在电泳仪上进行水化及等电聚焦电泳。而后将IPG胶条在含20 mmol/L DNP的2N的HCl溶液中室温孵育20 min，而后在含30%甘油的2 mol/L TrisBase溶液中洗15 min。

　　1.2.4 二向凝胶电泳

　　将平衡后的IPG胶条转移至12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)(16 cm×15 cm×1.0 mm)上端，在垂直电泳仪上进行二向电泳。待溴酚蓝距底边约4 cm时停止电泳。

　　1.2.5 分析胶进行Western印迹染色

　　将用作分析胶的二向胶电转移至硝酸纤维素膜。以3%牛血清白蛋白(BSA)/三羟甲烷缓冲盐水(TBS)T封闭硝酸纤维素膜。以1∶200的兔抗鼠DNP抗体作为一抗，4℃过夜孵育。以1∶10 000的羊抗兔碱性磷酸酶耦联抗体作为二抗，室温孵育1 h。以碱性磷酸酶显色试剂盒(BCIP/NBT)溶液作为显色液，至蓝紫色蛋白点清晰呈现后，以双蒸水终止反应。

　　1.2.6 制备胶进行热考马斯亮蓝染色

　　制备胶于20%三氯乙酸(TCA)中固定2 h以上。蒸馏水漂洗凝胶20 min，加入热考染液，50℃摇床振荡30 min。加入脱色液，50℃摇床振荡脱色，每次1 h，以背景蓝色脱净为止。

　　1.2.7 图像分析及质谱鉴定

　　扫描Western印迹及考染的制备胶图像，应用Image Master 2D Evolution软件进行分析，在制备胶上找到与Western印迹结果相匹配的蛋白点。对照组不存在而实验组存在的蛋白点进一步做质谱鉴定。

　　2 结 果

　　2.1 细胞模型结果

　　10 μmol/L PSI作用PC12细胞24 h的情况下，细胞存活率降至85.46%±1.75%(对照组设为100%)，与对照组比较差异显著(P<0.05);并且细胞多数处于包涵体形成阶段，较好地模拟PD的两大基本病理特征，即神经元丧失和神经元内嗜酸性包涵体的形成。因此，10 μmol/L PSI作用24 h的PC12细胞可作为研究PD发病机制及PD药物治疗的可靠模型。见图1。

　　对照组(图1A)PC12细胞胞浆嗜酸性染色，胞核嗜碱性染色。实验组(见图1B)PC12细胞体积增大，胞浆内出现嗜酸性包涵体(实心箭头所示)，胞核嗜碱性染色(空心箭头所示)

　　图1 HE染色结果(×200)

　　2.2 蛋白质鉴定结果

　　扫描考染的制备胶及Western 印迹图像，可见制备胶上的蛋白点与Western 印迹图像匹配较好。应用2D Evolution软件进行分析，对照组不存在而实验组存在的氧化蛋白点有8个，仅蛋白点77被质谱鉴定出来。美国国立生物信息中心(NCBI)蛋白质数据库提供的蛋白点77的详细信息为：蛋白质编号gi 92930，蛋白质名称β微管蛋白(tubulin)，等电点4.8，分子量50.38 kD，期望值(鉴定结果的差错几率)0.000，序列覆盖率(已经鉴定的肽段序列占蛋白质总序列的百分比)25.4%，提示鉴定结果可信度较高。见图2。

　　3 讨 论

　　PD的基本病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失，残存的神经元胞浆内出现嗜酸性包涵体即Lewy小体。黑质破坏导致纹状体中多巴胺含量减少，从而引起PD相应的临床表现。迄今为止，PD的病因和发病机制尚不完全清楚。目前多数学者将兴趣集中于氧化应激损害，认为氧化应激在PD黑质多巴胺能神经元死亡过程中起重要作用。

　　泛素-蛋白酶体系统(UPS)是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径，它可清除真核细胞内突变、损伤及异常折叠的蛋白质，起到调控蛋白质和维持细胞内环境稳定的作用〔3〕。有研究表明〔4，5〕，PSI处理的细胞和动物模型均能较全面地模拟PD的病理特征;并且与现有的其他模型比较具有诸多优点，因而成为研究PD新的有力工具。

　　蛋白质羰基是蛋白质氧化的特定标志之一〔6〕。数据显示，反应性羰基作为氧化损伤的神经毒性介质涉及许多神经系统变性疾病的进展〔7〕。并且，尸检研究亦表明PD黑质多巴胺能神经元内蛋白质羰基水平显著升高〔8〕，提示有必要从蛋白质氧化修饰的角度研究PD中氧化应激的作用。本实验首先通过DNP的衍生步骤将实验组和对照组含有羰基的氧化蛋白质标记上，而后采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western 印迹相结合的方法鉴定两组氧化修饰蛋白质的差异。结果发现，对照组不存在而实验组存在的氧化蛋白点为细胞骨架蛋白βtubulin。

　　细胞骨架是横越在细胞核和细胞膜内侧面的一种纤维状蛋白基质，在细胞形态的维持、运动性、胞内颗粒物质运输、有丝分裂等方面具有重要作用。细胞骨架由微管、微丝及中间纤维组成。其中，微管在决定细胞极性和神经元分化方面起作用〔9〕。微管由α和βtubulin组成，其中βtubulin为微管的基本结构，其表达水平可反映出神经元骨架的完整性。

　　微管系统的功能紊乱是许多神经系统变性病的促进因子。PD以黑质多巴胺能神经元的选择性丢失为特征，而多巴胺能神经元的长轴突内富含微管。PD毒素如鱼藤酮对微管的解聚作用可破坏囊泡的运输，细胞体内随后发生囊泡聚集，由于囊泡的渗漏导致胞浆内多巴胺浓度升高，而多巴胺自我氧化诱导的氧化应激可触发神经元选择性坏死〔10〕。可见，微管的破坏与多巴胺能神经元的凋亡有关。另外，Trimmer等〔11〕在PD杂交细胞包含体内检测到了抗βtubulin抗体的存在，提示βtubulin与PD的另一病理特征即包涵体的形成亦密切相关。

　　本研究在泛素PSI的PD细胞模型中发现了βtubulin的氧化修饰，而对照组βtubulin未发生氧化修饰，两组间差异有统计学意义，P<0.05，这种氧化修饰可能是蛋白酶体功能抑制导致的氧化损伤所致。

　　有报道〔12〕显示AD中微管蛋白的氧化导致蛋白功能障碍，引起细胞结构改变以及神经传递功能丧失，这在神经变性过程中发挥重要作用。本实验首次在PSI处理的PC12细胞PD细胞模型中发现βtubulin发生氧化修饰，推测βtubulin的氧化可能抑制微管聚合，促进微管分解，参与形成PD的主要病理变化，进一步提示了PD中氧化应激损伤机制的重要作用。同时也提示PD中抗氧化应激治疗的保护作用，为分子靶向治疗药物的研发提供有价值的线索。

　　【参考文献】

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