EphB4受体及其配体EphrinB2在喉鳞癌组织中的表达及与血

　　作者：代立媛,娄卫华　　作者单位：郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉-头颈外科，河南 郑州 450052

　　【摘要】目的 探讨EphB4受体及其配体EphrinB2在喉癌组织中的表达及与血管生成的关系。方法 应用免疫组织化学SP法检测61例喉癌和10例癌旁组织中EphB4受体及其配体EphrinB2的表达及间质微血管密度(MVD)。结果 喉癌组织中肿瘤细胞和间质新生血管的EphB4与EphrinB2高度表达，其表达与肿瘤细胞分化程度和临床分期密切相关(P<0.01，P<0.001)，但与肿瘤的临床分型和颈淋巴结转移无相关性(P>0.05)。EphB4与EphrinB2蛋白高表达组的平均MVD值明显高于EphB4与EphrinB2低表达组(P<0.001)。结论 EphB4与EphrinB2蛋白在喉癌的发生和演进过程中起着重要的作用，并与肿瘤血管密切相关。

　　【关键词】 喉鳞状细胞癌;EphB4;EphrinB2;微血管密度

　　Relationship between the expression of EphB4 and EphrinB2 with angiogenesis in laryngeal squamous cell carcinoma　　DAI Liyuan ,LOU Weihua　　Department of Otolaryngology and Head﹠Neck Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052,China

　　Abstract: Objective To investigate the expression of EphB4 receptor and its ligand EphrinB2 in laryngeal squamous cell carcinoma and their relation with angiogenesis.Methods Microvessel density(MVD) and the expression of EphB4 receptor and its ligand EphrinB2 were detected with immunohistochemistry in tumor specimens from 61 laryngeal squamous cell carcinoma cases and paratumor normal specimens from 10 cases.Results EphB4 and EphrinB2 had higher expression in laryngeal squamous cell carcinoma specismens than that in paratumor normal specimens.The expression of EphB4 and EphrinB2 was significantly correlated with differentiation grade and clinical stages(P<0.01，P<0.001), but not with lymphonodi cervicales metastasis and clinical type(P>0.05). The MVD values in group with high expression of EphB4 and EphrinB2 were significantly higher than those in group with low expression(P<0.001).Conclusion EphB4 and EphrinB2 may play important roles in the tumorigenesis and progression of laryngeal squamous cell carcinoma and may be closely associated with angiogenesis.

　　Key words: laryngeal squamous cell carcinomal; EphB4;EphrinB2;microvessel density

　　喉鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一。目前认为恶性肿瘤的发生和演变与多种基因的改变有关，肿瘤的发生和演进与肿瘤血管的生成密切相关[1]。EphB4/EphrinB2是Eph(erythropoietin producing human hepatocellular cell line)受体酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinases,RTKs)中的成员，是近几年国内外肿瘤研究的热点。本研究拟采用免疫组织化学方法检测61例喉鳞癌及10例癌旁组织中EphB4和EphrinB2的表达，并同时采用CD34蛋白的表达标记定量检测肿瘤微血管密度，旨在探讨它们在血管生成中的作用及与肿瘤原发部位、临床分期、细胞分化程度和颈淋巴结转移的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　61例喉癌及癌旁组织选自2004年至2005年郑州大学第一附属医院病理科，其中男59例，女2例;年龄43～75岁，平均59岁。高分化鳞癌17例，中分化鳞癌27例，低分化鳞癌17例。按1997年UICC喉癌分期标准[2]：Ⅰ期13例，Ⅱ期19例，Ⅲ期18例，Ⅳ期11例。声门上型17例，声门型44例。颈淋巴结转移组11例，无转移组50例。术前均未做放化疗。以10例癌旁组织作为对照。均行苏木精-伊红染色。病理证实均为喉鳞状细胞癌。EphB4和EphrinB2购于上海西宝生物有限公司，CD34和SP试剂盒购于公北京中山司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学法

　　采用SP法，切片脱蜡后滴加体积分数3%H2O2以灭活内源性酶;经微波炉修复抗原，山羊血清封闭后滴加稀释的一抗，4 ℃过夜，滴加生物素标记二抗，常温孵育15 min，滴加辣根酶标记的链霉素卵白素，常温孵育15 min，3，3四盐酸二氨基联苯(daiminobenzidine tetrahydrochloride,DAB)显色，苏木精复染，脱水透明，中性树脂封片。其中所有标本均严格控制实验条件并作常规苏木精伊红染色，将10例癌旁组织作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(phosphatic buffer solution,PBS)代替一抗，作为阴性对照。EphB4、EphrinB2和CD34的稀释浓度分别为1150、1150和175。

　　1.2.2 结果判定

　　(1)EphB4和EphrinB2染色结果判定根据文献报道的方法进行[3]。以肿瘤细胞阳性百分数及染色强度进行肿瘤细胞阳性记分。避开肿瘤边缘及坏死区域。根据阳性瘤细胞数目所占百分比分为4级：Ⅰ级0分，<10%;Ⅱ级1分，10%～25%;Ⅲ级2分，25%～50%;Ⅳ级3分，50%以上。按瘤细胞着色的深浅计分染色强度：1分;浅黄色;2分：黄色;3分：棕色。2个分值相加即为该标本的免疫组织化学阳性计分：0～1分为阴性，记为-;2～4分为弱阳性，记为+;5分以上为强阳性，记为++。(2)CD34以血管内皮细胞胞内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，按Weidner等[4]方法并加以改进。先在低倍镜下(×40，×100)选取肿瘤微血管数量(CD34阳性)最丰富的区域(热点)，在×200视野范围计算5个视野的微血管数目，取平均值作为MVD。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据用SPSS 10.0统计软件包处理，采用χ2检验及Fisher精确概率法，以P<0.05表示有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 EphB4和EphrinB2在喉癌组织中的表达

　　EphB4或EphrinB2的阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞浆、胞膜和血管内皮细胞。61例喉癌组织中，EphB4高表达33例，EphrinB2高表达30例;10例癌旁组织中EphB4和EphrinB2的高表达均为0例，2组比较具有显著性差异(χ2=10.108，P<0.01和χ2=8.517，P<0.01)。

　　2.2 EphB4和EphrinB2表达与MVD的关系

　　EphB4高表达组中MVD明显高于EphB4阴性组(t=6.020 9,P<0.001);EphrinB2高表达组中MVD值也明显高于EphrinB2低表达组(t=7.994 5,P<0.001)，见表1。表1 EphB4和EphrinB2表达与MVD的关系(略)

　　2.3 EphB4和EphrinB2的表达与临床病理指标的关系

　　喉癌组高分化、中分化和低分化EphB4高表达率分别为25.3%、59.3%和76.5%，差异有统计学意义(χ2=10.113,P<0.01)。根据临床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期EphB4高表达率分别为23.1%、47.4%、61.1%和90.9%，差别有统计学意义(χ2=11.743,P<0.01)。喉癌组高分化、中分化和低分化EphrinB2高表达率分别为23.5%、48.1%和76.5%，差异有统计学意义(χ2=9.553,P<0.01)。根据临床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期ephrinB2高表达率分别为7.7%、36.8%、72.2%和81.8%，差别有统计学意义(χ2=18.622,P<0.001)。另外，EphB4和EphrinB2阳性表达与肿瘤临床分型、肿瘤部位和颈淋巴结转移无关(χ2=0.492,P>0.05和χ2=5.720，P>0.05)，见表2。表2 喉鳞状细胞癌中EphB4和EphrinB2表达与临床病理的关系(略)

　　3 讨论

　　EphB4和EphrinB2是Eph受体酪氨酸激酶家族(RTKs)中的成员，Eph受体酪氨酸激酶是酪氨酸激酶家族中最大的1个亚族，目前发现有16种Eph受体和9个Ephrin配体。在Eph家族中配体与受体的结合专一性不是很强，但EphB4只与EphrinB2结合，EphB4和EphrinB2均存在于细胞膜上，通过细胞间信号传导起作用，其信号传导方式是双向信号机制，EphB4和EphrinB2互相作用导致两者均发生酪氨酸磷酸化，从而介导双向的信号传递，EphrinB2激活EphB4为正向信号，而 EphB4 激活EphrinB2为逆向信号。

　　Eph和Ephrin系统调节许多重要的生理过程，如在胚胎形成﹑轴突介导﹑神经网络构建等方面[5]。Adams等[6]研究显示：EphB4和EphrinB2在胚胎发育时期对血管的发生起了关键性作用。研究显示EphB4和EphrinB2可能在肿瘤的血管生成过程也有重要作用[7]。在许多肿瘤组织中EphB4和EphrinB2也存在着扩增和过表达，在肿瘤发生和发展中亦肯能有重要作用。研究表明，在肺癌、骨肉瘤、胃癌等肿瘤组织中EphB4和EphrinB2表达均高于相应的正常组织。Uttam等[8]发现EphB4在所有头颈部鳞状细胞癌的肿瘤标本和转移淋巴结都有表达，EphB4的蛋白表达水平和基因扩增在肿瘤的低分化(Ⅲ或Ⅳ)高于高分化(Ⅰ或Ⅱ)，同时PTPCR也证实了在肿瘤组织和转移淋巴结EphB 4基因扩增，低分化肿瘤(Ⅲ或Ⅳ)EphB 4基因扩增高于高分化(Ⅰ或Ⅱ)。本研究结果也证实在喉鳞癌组织中EphB4和EphrinB2也有明显的高表达，且EphB4和EphrinB2的表达与喉癌临床分期和细胞分化程度之间密切相关相一致。提示它们在喉癌的发生过程中可能起着一定的作用。但本实验中显示喉癌颈淋巴结转移与EphB4和EphrinB2的表达无相关性，这与Takai[9]关于EphB4在子宫内膜癌中的表达研究不完全一致，这可能与喉癌组织有不同于子宫内膜癌的生物学特性，也可能本实验标本例数较少，所得的结果不能反映真实情况。关于EphB4和EphrinB2参与肿瘤的发生和分子学机制尚不清楚，有待进一步阐明。

　　肿瘤生长是离不开营养和氧气，血管的生成不仅为肿瘤提供生存所需的营养和氧气，还为肿瘤细胞离开原发灶进入血液循环提供了有效的通路，而且转移灶的增殖也需要新血管的形成。CD34是血管内皮细胞特异性标记物，在间质和内皮干细胞的成熟及增殖中起重要作用[10]。CD34标记肿瘤间质MVD是血管生成的重要指标。有研究证明，EphB4可刺激细胞迁移和增殖在血管生成中有重要的作用，Ephrin配体通过双相信号途径与邻近内皮细胞上的 Eph受体相互作用促进了血管内皮细胞的芽生、迁移、增殖和管腔形成[11]，另有研究显示EphB4可上调血管内皮生长因子VEGF的表达，VEGF可以通过自分泌和旁分泌促进血管生成[12]。本研究显示，在EphB4和EphrinB2 低表达组的MVD值明显低于EphB4和EphrinB2高表达的MVD值，提示它们在肿瘤血管生成中可能起着重要作用。

　　本实验显示，EphB4受体及其配体EphrinB2在喉鳞癌中高表达，与肿瘤细胞的分化程度、临床分期和肿瘤的血管生成密切相关。虽然具体的分子机制有待进一步研究，但EphB4受体及其配体EphrinB2有望成为又一抗血管生成的靶向目标。

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