生物信息学方法推测脊椎动物血红蛋白相互作用机制

　　作者：王程,隋春红,秦文斌,雎天林,吕士杰　　作者单位：吉林医药学院：1.生化教研室，2.化学教研室，吉林 吉林 132013

　　【摘要】目的 通过分析脊椎动物血红蛋白(Hb)分子进化过程，解释Hb相互作用的现象并推测作用机制。方法 采用NCBI、PDB等在线生物信息学网站及SMS、ANTHEPROT 5.0、Clustalx 2.0、MEGA 4、Vector NTI 9等软件包对比脊椎动物门各纲羊膜和非羊膜动物Hb氨基酸多序列的同源相似性，查找保守位点，构建分子进化树，预测二级结构，对比三级结构模型，推测Hb相互作用现象的发生机制。结果 氨基酸多序列对比显示，非羊膜动物α链没有保守氨基酸(cAA)，β链有3个cAA，羊膜动物α链、β链分别有27个和68个cAA;分子进化树显示非羊膜动物Hb氨基酸每位点替代值(SpS)远大于羊膜动物(P<0.01);预测二级结构分析Hb作用面发现非羊膜动物α链40位氨基酸主要参与无规则卷曲结构，羊膜动物α链40位和β链94位氨基酸均主要参与α螺旋结构;对比空间结构模型发现羊膜动物α链均有一个苏氨酸(41位)与β链的组氨酸(98位)形成氢键，而非羊膜动物不能形成此氢键。结论 脊椎动物Hb相互作用发生的关键可能在于是否存在α链苏氨酸(41位)与β链组氨酸(98位) 形成的氢键。

　　【关键词】 生物信息学,血红蛋白;相互作用;氢键

　　Abstract:Objective To analyze the evolution process of hemoglobin (Hb) molecular in vertebrates,and explain the phenomenon of Hb interaction and extrapolate the function mechanism. Methods Amniota and nonamniota Hb amino acid multisequence homologous similarity was compared to find the conservative positions and create cladogram,the secondary structure was forecast and the tertiary structure models was contrast by online analysis at bioinformation websites such as NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),PDB(http://www.rcsb.org/),employing software package such as SMS，ANTHEPROT 5.0，Clustalx 2.0，MEGA 4，Vector NTI 9. Results Amino acid multisequence showed that the nonamniota αchain didn't not have conservative amino acid (cAA),βchain had 3 cAA,the amniota αchain,βchain had 27 and 68 cAA respectively;The cladogram demonstrated that the amino acid substitutions per site of nonamniota was bigger than the amniota (P<0.01);The forecasts of the secondary structure and analysis of Hb active surface discovered that the nonamniota α40 amino acid participated manly in the nonregular curl structure，both amniota α40 and β94 amino acids participated mainly in αhelix;The contrast among the spatial structure models discovered there was in both αchain threonine (41) and βchain histidine (98) which formed a hydrogen bond respectively in amniota αchain，but there wasn't any in the nonamniotas. Conclusion The key of occurrence of Hb interaction in vertebrates might be lie in whether there was a hydrogen bond formed from αchain threonine (41) between βchain histidine (98).

　　Key words:biological information sciences;hemoglobin;interaction;hydrogen bond

　　自从发现人血红蛋白(hemoglobin，Hb) A与Hb A2可以发生相互作用[1]，即推测这种相互作用可能是各种血红蛋白之间的普遍规律。但通过实验证实，人类、哺乳纲、鸟纲及大部分爬行纲动物的Hb之间可发生相互作用(简称互作)，但不能与小部分爬行纲、两栖纲、鱼纲动物Hb发生互作，小部分爬行纲、两栖纲、鱼纲动物Hb之间也不能发生互作[26]。因此推断Hb互作发生的分水岭可能存在于羊膜动物和非羊膜动物之间，互作的机制在于Hb分子进化过程中珠蛋白的氨基酸不断发生置换来改变空间结构，满足物种对环境的适应有关。本研究采用生物信息学方法，通过分析Hb分子进化过程，解释Hb互作的现象并推测作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　随机选择脊椎动物门各纲代表动物氨基酸序列及空间结构图像，材料来源于NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和PDB数据库 (http://www.rcsb.org/)。如下所列：七鳃鳗(Lamprey，HbⅠ:BAF47284，HbⅡ:BAF47285,PDB ID:1UC3)，盲鳗(Hagfish,HbA:1IT2_A,HbB:1IT2_B),鲨(shark,Hbα:P07408,Hbβ:P07409,PDB ID:1GCV),电鳐(Torpediniformes,Hbα1:P20244,Hbβ1:P20246),肺鱼(lungfish,Hbα:P02020,Hbβ:P02138),空棘鱼(Coelacanth,Hbα:P23740,Hbβ:P23741),金枪鱼(Tuna,PDB ID:1V4U),鳟鱼(Trout,PDB ID:1OUT),鲤鱼(carpio,Hbα:P02016,HbβA/B:P02139),大黄鱼(crocea,Hbα:AAV52697,Hbβ:AAV91971，PDB ID:1SPG),蝾螈(Salamander,Hbα1:P06640),蟾蜍(Bufonidae,Hbα:AAN41264,Hbβ3:P02011),蛙(Rana,Hbα3:P02011,Hbβ:P02135),蛇(snake,Hbα:P41331,Hbβ:P41332),蜥蜴(Lizard，Hbα:AAB20248,Hbβ:AAB20247),龟(Turtle,HbαA:AAB33014,Hbβ:AAB33015,PDB ID:1V75),鳄(crocodile,Hbα:P02131,Hbβ:P02130),鹦鹉(Parrot,PDB ID:2ZFB),鸡(chicken,Hbα1:NP_001004376,Hbβ:NP_001075173,PDB ID:1HBR),鸵鸟(Ostrich,HbαA:P01981,Hbβ:P02123),鹅(goose,HbαA:P689454,Hbβ:P01991，PDB ID:1A4F),鸭嘴兽(Platypus,Hbα:P01979,Hbβ:P02111),袋鼠(Kangaroo,Hbα:P01975,Hbβ:P02106),蝙蝠(bat,Hbα:AAB24575,Hbβ:AAB24574),兔(rabbit,Hbα:711680A,Hbβ:660912A),小鼠(mouse,Hbα:P11757,Hbβ:P11758),大鼠(rat,Hbα:P01943,Hbβ:P02090),猫(cat,Hbα:P07405,Hbβ:P68871),犬(dog,Hbα:P07405,Hbβ:P04244,PDB ID:2B7H),狼(PDB ID:1FHJ),鲸(Whale,Hbα:P18978,Hbβ:P18984),马(horse,Hbα:P01958,Hbβ:P02062，PDB ID:1G0B)，驴(donkey,PDB ID:1S0H),猪(pig,PDB ID:1QPW),牛(cow,Hbα:P01966,Hbβ:P02070,PDB ID:1G09),黑猩猩(Chimpanzee,Hbα:P69907,Hbβ:P68873),猴(monkey,Hbα:P63108,Hbβ:P02030),人(human，Hbα:P69905,Hbβ:P68871，PDB ID:1A3N),人小鼠互作(PDB ID:1JEB)。

　　1.2 方 法

　　应用SMS软件包，以100%相似率，亮氨酸(leucine,L)、异亮氨酸(isoleucine,I)、缬氨酸(valine,V)，色氨酸(tryptophan,W)、苯丙氨酸(phenylalanine,F)、酪氨酸(tyrosine,Y),赖氨酸(lysine,K)、精氨酸(arginine,R)、组氨酸(histidine,H),天冬氨酸(aspartic acid,D)、谷氨酸(glutamic acid,E)，甘氨酸(glycine,G)、丙氨酸(alanine,A)、丝氨酸(serine,S),脯氨酸(praline,P),半胱氨酸(cysteine,C),苏氨酸(threonine,T)、天冬酰胺(asparagines,N)、谷氨酰胺(glutamine,Q)、蛋氨酸(methionine,M)八个类似性氨基酸组，对比羊膜和非羊膜动物Hb氨基酸多序列的同源相似性，查找保守位点，构建分子进化树。应用Clustalx 2.0、MEGA 4软件包构建进化树，SPSS 11.5统计羊膜和非羊膜动物氨基酸每位点替代值(substitutions per site,SpS)的差异，P<0.01有意义。应用ANTHEPROT 5.0软件包预测Hb二级结构，比较Hb亚基接触面上αN首位、α40、α126、α140/C末位、β94、β146/C末位8个氨基酸参与形成的二级结构。应用Vector NTI 9软件包分析α39～42、β94～98氨基酸支链的氢键空间结构。

　　2 结 果

　　2.1 同源性分析

　　氨基酸多序列对比显示，非羊膜动物以蛙为参照，α链没有保守氨基酸(Conservative amino acid,cAA)，β链有3个cAA:131(V)、135(L)、139。羊膜动物以人为参照，α链有27个cAA:40(L)、56(V)、59(H)、60(G)、62(K)、63(V)、66(A)、70(A)、75(D)、82(S)、84(L)、85(H)、87(L)、88(H)、93(R)、94(V)、95(D)、98(N)、99102(L)、111(A)、113(H)、125(S)、128(K)、133(V)、137(L)、141(Y)、142(R)，β链68个cAA:8(E)、9(K)、12(V)、16(W)、18(K)、19(V)、25(G)、26(G)、29(L)、30(G)、33(L)、34(V)、35(V)、36(Y)、37(P)、38(W)、41(R)、43(F)、46(F)、47(G)、55(V)、58(N)、61(V)、64(H)、65(G)、67(K)、68(V)、69(L)、71(A)、72(F)、73(S)、75(G)、79(L)、80(D)、82(L)、83(K)、86(F)、87(A)、89(L)、90(S)、92(L)、93(H)、94(C)、96(K)、98(H)、99(V)、100(D)、101(P)、104(F)、107(L)、108(G)、111(L)、112(V)、115(L)、116(A)、122(E)、123(F)、131(Y)、132(Q)、133(K)、134(V)、138(V)、139(A)、141(A)、142(L)、143(A)、146(Y)、147(H)。

　　2.2 分子进化树的构建与分析

　　对羊膜动物和非羊膜动物的Hbα、β亚基构建分子进化树，如图1～4。分别对Hbα、Hbβ的氨基酸SpS进行独立小样本t检验，非羊膜动物Hbα、Hbβ氨基酸SpS均显著大于羊膜动物(P<0.01),即非羊膜动物Hbα、Hbβ氨基酸变异较羊膜动物大。

　　2.3 二级结构预测与分析

　　羊膜动物和非羊膜动物Hb二级结构预测，如图5～8。 Hb亚基之间主要通过8对盐键连接，涉及αN首位、α40、α126、α140/C末位、β94、β146/C末位8个氨基酸[7]，比较这些氨基酸参与形成的二级结构，发现αN首位、α126、α140/末位和β146/末位5个氨基酸均为较保守结构，羊膜动物和非羊膜动物无区别，αN首位为无规则卷曲 (nonregular curl,C) 结构或β折叠 (βsheet,S) 结构，α126为α螺旋 (αhelix,H) 结构，α140/末位多为β转角结构(βturn,T)或C结构，β146/末位多为C结构。α40、β94参与形成的二级结构有了明显变化，但保守于羊膜动物和非羊膜动物内部，非羊膜动物α40主要参与C结构，非羊膜动物β94参与的二级结构多样化，包括H、C、S结构;羊膜动物α40和β94均参与H结构。

　　2.4 空间结构分析

　　根据羊膜动物和非羊膜动物二级结构的变化，观察空间结构模型Hbα35～45氨基酸支链，发现羊膜动物Hbα41 T与Hbβ98 H形成氢键(TH氢键)，而非羊膜动物Hb没有，如图9。羊膜动物Hb互作时，也存在此氢键，如图10。TH氢键结构由T的羟基与H的羰基连接，如图11。TH氢键具有AH…B(OH…O)形式，键角约165°,键长为(0.359±0.053)nm，根据Desiraju GR[8]氢键判定方法为弱氢键或羟基氢桥。

　　3 讨 论

　　Hb在体内分布十分广泛，是研究各种动物之间亲缘关系及系统进化上的良好材料。Morris Godman[9]通过比较55种不同种属动物Hb的氨基酸序列后推导出了进化树和Hb的进化规律。本研究室长期以来一直进行Hb的研究，发现了脊椎动物Hb互作的现象，但互作机制一直没有明确的解释。一般认为，Hb两种能发生互作，这两种Hb须分别解聚成二聚体，并通过离子键及范德华力相互连接，组成新的杂交四聚体分子[10]。裴娟慧[11]推测互作两种Hbα、β亚基接触面上必须同时含有一个“互作结构域”。刘小舟[12]等对已知结构的哺乳纲、鸟纲和鱼纲Hb的晶体结构数据进行了比较，发现鸟纲和鱼纲Hb各亚基间的距离比哺乳纲大,α1β1亚基间距离：鱼纲>鸟纲>哺乳纲，而且一级结构比较发现，鸟纲、鱼纲和哺乳纲Hb的残基选择性不同，鱼纲Hb分子表面和亚基之间的界面倾向于选择侧链更大的残基，这可能与非羊膜动物不发生互作有关。Tsai[13]认为蛋白质折叠的主要动力是疏水作用，但单纯依靠疏水作用不能单独使蛋白质发生互作。而静电作用可使蛋白质发生互作，参与的化学基团一般是NH3，COOH，OH，SH和=O等[14]，所以Hb互作必然有氢键的参与。于慧[15]等计算锦龟与人的静电势分布，发现保守残基处有相似性。用生物信息学方法做假设：1)检查多种动物Hb氨基酸同源相似性，发现Hbα、β亚基前段比后段保守氨基酸多，进化树分析非羊膜动物Hbα、β氨基酸变异较羊膜动物大，推测“互作结构域”会存在于羊膜动物Hbα、β的前段保守氨基酸序列中;2)Hb互作应该发生在亚基接触面上，Hb亚基之间主要通过8对由支链氨基 (HH3)和支链羧基(COOH)构成的盐键连接，这些连接与其二级结构基础有密切联系，比较连接Hbα、β亚基的氨基酸所参与形成的二级结构，发现非羊膜动物α40主要参与C，羊膜动物α40和β94均主要参与H，推测“互作结构域”会存在于羊膜动物α40和β94所构成的二级结构中。取以上两推测的交集，观察空间结构模型Hbα35～45氨基酸支链，发现羊膜动物Hbα41 T与Hbβ98 H形成TH氢键，而非羊膜动物Hb没有。羊膜动物Hb发生互作时，也存在此氢键，因此推测Hb互作与此氢键有关，即Hb互作发生的关键可能在于是否存在TH氢键。

　　利用TH氢键的推断可以很好的解释一些Hb互作时的一些现象。由于只有羊膜动物有TH氢键，故Hb互作只发生在羊膜动物之间。而羊膜动物与非羊膜动物之间也不能发生互作，是因为互作的两种Hb必须同时具有TH氢键，Hb互作实验在淀粉琼脂糖凝胶电泳中进行。两种Hb互作之后，互作时形成的杂交四聚体分子不能牢固结合，其原因可能是在互作时形成的TH氢键不牢固，同种Hbα、β亚基很快恢复自身连接的氢键。同种Hbα、β亚基自身连接氢键多，连接力大，故在凝胶中不易分离。Hb互作现象是一个复杂的过程，TH氢键作用只是基于结构同源性的一种推测，对Hb互作现象机制的研究还需要大量的先进实验来证明。

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