气管狭窄瘢痕的基础研究现状

　　作者：汤苏成　　作者单位：佛山市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科， 广东 佛山 528000

　　【摘要】喉、气管瘢痕性狭窄的治疗在耳鼻咽喉头颈外科工作中经常遇到，虽然方法不断改进，仍有部分患者需长期甚至终身带管，并丧失部分发音功能，瘢痕复发是治疗失败的主要原因，我们应深入了解瘢痕的特点和形成机制。

　　【关键词】 喉、气管狭窄,增生性瘢痕

　　Rousseau等[3]研究犬声带的创伤瘢痕发现，喉瘢痕光镜下表现为声带固有层中弹力纤维呈碎片状、结构紊乱，此外,胶原蛋白的含量也显著增加,在声带固有层瘢痕中形成较粗的束条样结构，成纤维细胞的密度增高，核大，深染。同样，吴旋等[4]通过纤维的特殊染色如胶原纤维的Massion三色法、苦味酸-天狼猩红染色、弹性纤维的阿尔辛蓝染色等研究半喉切除术后喉狭窄瘢痕中发现胶原纤维异常增多、粗大、排列紊乱，而出现在正常组织皮下的弹性纤维蛋白网断裂或缺如。电镜下可见，瘢痕组织由大量粗的、厚度不同、方向混乱、包以嗜酸性细胞的胶原纤维组成，胶原丝中胞质内丝和粗面内质网槽的胞浆突起。成纤维细胞胞质内粗面内质网丰富，游离核糖体丰富，核大、核仁亦大，常染色质丰富，提示细胞处于高分泌状态[35]。喉气管狭窄瘢痕的病理特征表现为成纤维细胞的过度增生、细胞外基质的过度沉积和成分改变。

　　2 影响因素

　　2.1 缺氧 缺氧可能是诱发喉、气管增生性瘢痕的重要因素。蒋爱云等[6]研究发现，喉瘢痕纤维组织中血管数量明显减少,大多数处于内皮细胞增生、基板增厚、管腔闭塞或部分闭塞的状态，提示组织处于缺氧状态。Takahashi等[7]发现，低氧环境中培养的成纤维细胞可持续性高表达脯氨酸、胶原蛋白,而间质金属蛋白酶3表达降低,导致创伤后胶原的沉积。杨宝绮等[8]进行了动物及临床试验证实，应用活血化於的中药改善微循环后，可有效抑制喉瘢痕形成，增加拔管率。

　　我们认为，缺氧还可导致喉黏膜创面的愈合时间延长，肉芽组织增生，从而导致黏膜下瘢痕增生。

　　2.2 黏膜或皮肤的延迟愈合 喉瘢痕形态学观察证实，喉黏膜损伤程度决定喉瘢痕的结构，黏膜完整时胶原纤维丰富，排列尚规则，黏膜缺损往往导致大量胶原纤维的沉积，排列紊乱，往往导致瘢痕狭窄[9]。Garner等[10]将上皮细胞与成纤维细胞共同培养，发现成纤维细胞合成的胶原纤维明显低于单独培养组。

　　我们认为上皮细胞对组织修复有指导意义。Bellemare等[11]用类似的方法研究发现正常上皮角化细胞可以抑制成纤维细胞活性，而增生性瘢痕源性的角化细胞则促进成纤维细胞分泌胶原和细胞外基质，证明正常上皮组织的缺失在瘢痕形成中有重要作用。

　　2.3 慢性炎症反应 吴旋等[12]研究表明，慢性炎症细胞特别是巨噬细胞和T淋巴细胞在喉瘢痕组织中异常增高。喉腔创面在呼吸道感染、细菌刺激、胃液返流等因素刺激下可产生严重的炎症反应，且持续存在，大量的巨噬细胞和T淋巴细胞迁移至创面，释放大量的细胞因子，刺激成纤维细胞合成和分泌胶原纤维等细胞外基质，导致瘢痕形成。Tredget等[13]发现最终发展成增生性瘢痕的患者，在创伤1个月后，组织中Th2淋巴细胞的含量开始增高，持续约一年。

　　有学者认为进一步研究体外培养的增生性瘢痕源性的Th2细胞发现，细胞分泌的可促进瘢痕形成的IL4，IL10和转化生长因子β(TGFβ)明显增高。而抑制瘢痕形成的干扰素(INFγ)、IL12则低于正常愈合创面。

　　2.4 细胞外基质 如前所述，细胞外基质特别是胶原纤维的异常沉积和成分改变，是喉、气管狭窄瘢痕的病理特征。胶原是瘢痕细胞外基质的主要成分, 它的合成与降解的不平衡与瘢痕的形成密切相关。瘢痕组织中胶原纤维大量沉积，排列紊乱，主要以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主。同时，Ⅰ/Ⅲ胶原比例也发生改变，胶原的过度分泌和降解减少是胶原沉积的主要原因。Ghahary等[14]研究表明，增生性瘢痕中胶原生成量是正常组织的3倍。胶原合成的关键酶脯氨酸羟化酶的也含量明显增加。而降解胶原的主要物质-胶原酶含量和活性明显降低。

　　弹性纤维出现在正常声带、皮肤的固有层，交织成网。弹性纤维有一定的韧性，是皮肤和声带富有弹性的基础。增生性瘢痕中，弹性纤维明显减少或缺如，弹性纤维网断裂。导致瘢痕变硬、失去弹性。吴旋等[4]研究喉手术后喉瘢痕狭窄证实喉瘢痕组织中弹性纤维明显减少，纤维网断裂，被胶原纤维取代。

　　正常组织中，纤维连接蛋白(Fn)主要成纤维细胞、血管内皮细胞，巨噬细胞合成和分泌，也可有血浆转化而来。Fn是一组与创伤修复关系最密切的结构性糖蛋白，是细胞外基质重要成分，在创伤修复过程中具有重要作用。既往研究表明，Fn为炎症细胞迁移提供基质和趋化信号，对成纤维细胞、上皮细胞和血管内皮细胞有趋化作用，促进其游走和铺展，调节其增殖、分化、细胞因子及整合素受体的表达，促进肉芽组织向创伤区生长，并为新基质的形成提供支架[15]。Fn在创伤愈合早期出现，然后再4周至3月内消失，由胶原结缔组织代替。如果Fn持续呈高水平表达可能使成纤维细胞和内皮细胞的凋亡速度减慢或凋亡不足或中断，成纤维细胞相对过剩，导致喉腔创面发展成为以过度细胞(尤其是成纤维细胞)成分为特征的增生性瘢痕[16]。

　　透明质酸(HYA) 是一种葡萄糖胺聚糖, 属于蛋白聚糖, 在皮肤和声带固有层大量存在,透明质酸被认为是无瘢痕愈合的重要因子,被认为能阻止和控制瘢痕形成。声带创伤后2～4d时HYA浓度亦呈高水平,但很快消退[17]。在成人损伤组织中加入透明质酸, 能加快创伤愈合和减少瘢痕形成[18]。透明质酸的低水平可能是瘢痕形成的重要原因。

　　2.5 成纤维细胞 成纤维细胞在组织的创伤愈合中起着重要作用, 目前认为它在肉芽形成、 伤口收缩、基质合成、伤口修复、瘢痕形成等方面起着重要作用, 是合成细胞外基质主要细胞。成纤维细胞的增殖和功能活跃是增生性瘢痕形成的关键。

　　2.5.1 失凋亡状态 Desmonliere 等[19]等发现，正常创伤愈合后期，当上皮化完成之后，成纤维细胞就进入凋亡过程，最终消失，瘢痕亦停止生长，成为扁平瘢痕。如果成纤维细胞不能进入凋亡途径，而是在伤口增殖，继续表达细胞外基质沉积在伤口，就会导致增生性瘢痕的产生。汪琴等[20]研究发现，增生瘢痕的增厚期的成纤维细胞凋亡指数低于成熟期,远低于非增生性瘢痕。Linge等[21]分别分离正常组织和增生性瘢痕源性的成纤维细胞(NF和HF)，在体外培养后加入胶原中，发现胶原收缩后，NF的凋亡率为35%～45%，而HF几乎没有凋亡。

　　2.5.2 高代谢状态 增生性瘢痕组织中的成纤维细胞(HF)与正常组织中的成纤维细胞(NF)相比有明显的生物学特性。除了具有更强的分泌胶原的能力外，成纤维细胞还分泌一系列的细胞因子介导瘢痕的形成。Colwell等[22]研究发现，体外培养的HP可分泌较高浓度的结缔组织生长因子(CTGF)，它可以促进细胞外基质的合成。这一分泌在受到转化生长因子β2(TGFβ2)刺激后更加明显。Wang等[23]发现体外培养的HP中TGFβ1mRNA与正常组织相比有显著差别，提示HP有更强的TGFβ1分泌能力。Hathaway等[24]研究显示,HP分泌的胰岛素样生长因子相关蛋白是NP的两倍，其产物IGF1,3具有强烈的刺激胶原合成的作用。

　　2.6 细胞生长因子 创伤愈合是多种细胞、细胞因子和细胞外基质之间相互作用的复杂的动态过程。生长因子在整个创伤愈合过程中起着举足轻重的作用。同样，在瘢痕形成过程中，生长因子调控着成纤维细胞的增生代谢。生长因子的过渡表达，直接参与了瘢痕的形成。

　　转化生长因子β(TGFβ)是促进瘢痕增生的主要刺激因子。TGFβ1、2可刺激成纤维细胞分泌纤维连接蛋白，Ⅰ、Ⅲ型胶原和前胶原。还可减少胶原酶降解细胞外基质的作用，并间接地通过PDGF刺激细胞外基质的产生，促进瘢痕增生。TGFβ3则有对抗TGFβ1、2的作用。Scioscia等[25]发现喉瘢痕组织中，TGFβ和PDGF可见明显表达。

　　我们认为这两种细胞因子可以促进纤维化和细胞外基质的过渡表达，导致喉狭窄。 Lu[26]等在兔耳瘢痕模型上研究TGFβ抗体治疗增生性瘢痕发现，早期的应用抑制了上皮和肉芽组织形成，但不能抑制瘢痕的形成。而中晚期的应用可显著抑制瘢痕形成。在创伤愈合早期TGFβ的表达是愈合所必须的，并不会导致瘢痕的形成，而TGFβ在创伤愈合中晚期的持续表达在瘢痕生长中起到了关键作用。

　　其他如血小板源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、 表皮生长因子( EGF), 白细胞介素(IL1) 等均在增生性瘢痕组织中表达增高[27]。它们可通过各种途径促进成纤维细胞增殖和胶原纤维分泌。

　　2.7 基因表达与调控 随着对瘢痕形成机制的深入研究，基因表达调控在瘢痕形成及发展中的作用也越来越被学者们重视。成纤维细胞的凋亡的调控就是研究的热点。Bcl2是主要的抑制凋亡基因，而fas则是一种促凋亡基因。刘勇等[28]发现，bcl2蛋白在38.6%的增生性瘢痕组织的成纤维细胞中的表达，明显高于正常皮肤(6.78%)，而fas基因表达则无差异。Wassermans等[29]则发现增生性瘢痕组织的成纤维细胞中fas表达降低，但没有检测出bcl2。虽然各家报道不太一致，但基因调控的紊乱导致成纤维细胞失凋亡已经被大家所公认。与TGFβ相关的基因调控被认为是基因治疗的突破点。TGFβ与Cmyc和Cfos的表达密切相关。Cmyc和Cfos蛋白在增生性瘢痕中呈强阳性表达，主要分布于成纤维细胞、血管内皮细胞等功能活跃的细胞中，图像分析表明，Cmyc和Cfos在增生性瘢痕中表达亦明显增高[30]。Roberts 等[31]用基因敲除方法删除Smad3基因片段,能有效阻断TGFβ的病理作用, 使愈合伤口面积缩小、上皮组织再生及愈合速度加快, 减少伤口的过度修复。

　　3 前景与展望

　　近十年来，随着对增生性瘢痕在组织学、细胞学乃至分子生物学方面的研究进展，我们对喉、气管狭窄的形成机制也有了初步的了解，也在很大程度上改善疗效。相信，随着对凋亡相关基因、生长因子相关基因、信号传导系统、细胞外基质等影响瘢痕形成的因素及其相互作用的进一步研究，喉、气管狭窄的形成机制将最终阐明，由此也将带来治疗上的革命。

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