染色体端粒的缺失表达在头颈部磷癌的意义
发表时间：2009-06-29 浏览次数：666次
作者：吕梅,董震,杨占泉
【关键词】 头颈部鳞癌；染色体；端粒
摘 要：目的 通过对头颈部鳞癌（HNSCC）细胞系染色体端粒表达的检测和分析，研究端粒功能失调现象是否存于HNSCC，探讨其在促进肿瘤染色体变异的重要作用。方法 8个HNSCC细胞系和6例头颈部正常组织上皮细胞培养。收获细胞用荧光结合（CCCTAA）3核酸探针以荧光原位杂交方法检测细胞分裂中期染色体末端端粒表达，计算平均每个细胞中端粒缺失染色体末端数。结果 缺失TTAGGG重复DNA序列的染色体末端数/细胞的平均数为12.8±5.4；正常对照组上皮细胞不表现或仅偶尔出现染色体端粒缺失现象，平均值0.3±0.3。两组比较有显著差异（P＜0.005）。结论 HNSCC染色体端粒缺失，引起端粒功能失调造成双着丝粒及环状染色体形成，促使癌细胞异常分裂，致使HNSCC染色体不稳定性，以及大量基因组失衡。
关 键 词：头颈部鳞癌；染色体；端粒
Telomeric loss in head and neck squamous cell carcinomas
L Mei1，DONG Zhen2，YANG Zhanquan2 (1.Department of Otolaryngology, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian, Liaoning Province, 116011; 2.Department of Otolaryngology & Head and neck surgery, ChinaJapan Union Hospital, Jilin University, Changchun, Jilin Province, 130031, China)
Abstract:Objective To explore the mechanisms of chromosome aberrations, we studied the chromosome telomeres expression in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines. Methods Cell cultures of 8 HNSCC cell lines were harvested by middle metaphage, chrosomal telomeric TTAGGG repeats were detected by in situ hybridization with fluoresceinconjugated (CCCTAA)3 peptide nucleic acid probes. Epithelial cell cultures from 6 normal head and neck tissues were used as normal controls. Results All HNSCC cell lines showed TTAGGGnegative chromosome ends with the average number of 12.8±5.4 per cell. But the normal controls scarcely present the events, with the average number of 0.3±0.3. The average number of HNSCC cell lines was significantly higher than that of normal controls（P＜0.005）. Conclusion Shortening of telomeric repeats disrupted normal mitotic process by triggering chromosomal abnormal, thus leds to the development of complex genomic imbalances.
Key words:head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC); chromosome; telomere
头颈部鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）常表现为大量、复杂的染色体变化，但其潜在的机制目前尚不完全清楚。端粒是人类染色体末端一组TTAGGG DNA重复顺序，具有维持染色体稳定性的功能［1－2］。以往研究发现端粒的缩短或丢失可引起染色体末端的融合，促进染色体双着丝粒及环状染色体形成［3］。本研究通过对HNSCC细胞系染色体端粒表达的检测和分析，研究端粒功能失调现象是否存于HNSCC，探讨其在促进肿瘤染色体变异的重要作用。
1 材料与方法
1.1 材 料
8个HNSCC细胞系。来源部位：喉部3例，鼻窦部2例，口腔2例，鼻咽部１例（香港大学解剖教研室SaiWah Tsao教授赠给）；6例正常对照组织：2例下鼻甲粘膜上皮（来自耳鼻喉科鼻整形病人），2例鼻咽部粘膜上皮（来自鼻咽癌病人正常侧活检），2例正常喉粘膜组织（来自喉癌患者）短期传代（≤4代）上皮细胞培养。
1.2 细胞培养
头颈鳞癌细胞系在RPMI1640培养液（含10%小牛血清，100 IU/ml青霉素，0.2 mg/ml链霉素，2.5 μg/ml二性霉素）载玻片培养瓶中培养。正常对照上皮组织剪碎后，180 U/ml胶原酶Ⅱ、37℃孵育过夜；然后放入胶原包被的载玻片培养瓶中培养，培养液为角化细胞培养液（含0.23 mg/ml L谷酰胺，100 IU/ml青霉素，0.2 mg/ml链霉素， 2.5 μg/ml二性霉素）。在倒置显微镜下观察细胞大体生长状态，当细胞生长到90%满时，拆除培养瓶顶壁，收获载玻片。
1.3 分裂中期细胞收获及染色体片置备
培养液加入秋水仙素至终浓度0.1 μg/ml，37℃培养过夜；0.25%胰酶EDTA 37℃消化，用含10%血清的RPMI培养液终止反应，1000RPM离心10 min。逐滴加入0.06 mol/L KCL溶液裂解细胞，甲醇：冰醋酸（3：1）固定，滴3~4滴细胞悬液在浸于4℃水的载玻片上，60℃烘烤玻片过夜，将玻片浸于2×SSC中，60℃作用3 h。用清水冲洗玻片，自然晾干。
1.4 端粒荧光原位杂交检测
染色体载玻片用含10 mg/ml 胃蛋白酶的0.01 mol HCL 37℃作用15 min，1%甲醛固定10 min，70%－85%－100%酒精系列脱水；滴加荧光结合（CCCTAA）3核酸探针(瑞典Lunder大学Gisselsson博士增给)5 μl，加盖玻片，80℃变性2 min；室温下湿盒内杂交2 h，于70%甲酰胺15 min 2次，经系列脱水后DAPI 20 μl复染。细胞遗传学影像分析仪荧光显微镜下观察及摄像。
1.5 统计学分析
计算平均每个细胞中端粒缺失染色体数，每个细胞系至少分析20个细胞。肿瘤组与对照组数据平均值t检验，P＜0.05有显著差异。
2 结 果
HNSCC细胞系表现不同程度的染色体末端TTAGGG荧光信号缺失（代表端粒过度缩短或丢失），缺失TTAGGG重复DNA序列的染色体末端数/细胞的平均数为12.8±5.4（图1）。而正常对照组上皮细胞不表现或仅偶尔出现染色体缺失现象，平均值为0.3±0.3。肿瘤组和对照组的两组数据比较均有显著差异，t值为5.68，P＜0.005。 图 1 HNSCC组染色体端粒荧光原位杂交检测（部分染色体末端端粒荧光信号缺失）
3 讨 论
端粒作为线形染色体末端的基因元素，对维持染色体的结构和功能至关重要。所有真核生物的端粒都具有一相同的TTAGGG重复顺序。端粒保护功能失调可引起染色体双链的断裂，导致细胞长期处于G1期，促进细胞的衰老过程。而过度缩短的、不稳定的端粒又可造成染色体自身及相互之间的末端融合，形成双着丝粒染色体或环状染色体［3］。
含有双着丝粒染色体或环状染色体的细胞进入细胞分裂期，将出现染色体不对称断裂，造成含多个拷贝的某些染色体成分和丢失该成分的染色体断端分别分配入两个子细胞中。当子细胞中染色体断端染色单体再次融合、复制进入下一细胞分裂周期，则必将导致某些基因成分的不断扩增，及某些基因成分的不断丢失［4］。有趣的是染色体的易裂点往往是DNA修复、检测基因和促进细胞分裂增殖的癌基因的定位点［5］，说明端粒功能失调引起染色体不断的变异，造成了癌基因的活化、扩增，以及抑癌基因的抑制及丢失。
正常新生细胞均具有稳定的端粒表达，正如本研究正常对照组织早期细胞培养所示。但随着细胞的不断分裂，染色体端粒将不断缩短，甚至丢失［6］。而端粒酶，即端粒逆转录酶，与端粒始端结合，不断合成TTAGGG重复顺序，维持并延长端粒的长度。正常细胞的端粒酶活性处于抑制状态；而异常分化细胞或肿瘤细胞的端粒酶活性增高，促进端粒延长，稳定染色体结构，使癌细胞获得不断增殖的能力［7］。
在本研究中，HNSCC细胞内染色体端粒均有不同程度的缺失，说明肿瘤端粒酶活化并不能足以完全维护染色体的稳定性。最新研究资料表明，端粒酶的活性与端粒的长度并不成正比。以往在表达端粒酶的侵袭性肿瘤研究中，同样也发现大量染色体末端TTAGGG重复顺序的缺失。然而，不容质疑的是端粒酶是促进癌细胞染色体不断变化发展，抑制细胞因分裂异常衰减的重要调节因子［8］。
通常染色体断裂、不稳定将导致细胞的衰老或凋亡。肿瘤细胞染色体端粒功能失调，细胞不断异常分裂能够存在的先决条件是某些DNA检测、修复基因的功能受到抑制，允许含有断裂、不稳定染色体的癌细胞获得继续分裂、增殖的能力。如在胰腺癌端粒功能失调现象的研究中，同时发现变异的TP53基因表达。［9］
总之，通过本实验研究发现，HNSCC染色体端粒功能失调促使癌细胞不断异常分裂，致使HNSCC染色体不断变异，进而导致大量基因失衡，即癌基因的活化、扩增，抑癌基因的抑制及丢失。相反这些基因改变又促进或维持了癌细胞染色体端粒缺失的继续存在。多种因素的相互作用最终导致HNSCC的恶性发展。
HNSCC细胞中染色体末端端粒过度缩短或丢失，导致染色体间断裂和融合，形成双着丝粒或环状染色体，促使癌细胞不断异常分裂，致使HNSCC染色体结构不断变异，进而导致大量基因组改变，在HNSCC肿瘤发生、发展过程中起重要的作用。
参考文献：
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［7］ Harley C B, Kim N W, Prowse K R, et al. Telomerase, cell immortality, and cancer［J］. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1994, 59:307－315.
［8］ Gisselsson D, Jonson T, Petersen A, et al. Telomere dysfunction triggers extensive DNA fragmentation and evolution of complex chromosome abnormalities in human malignant tumors［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98 (22): 12683－12688.
［9］ Lengauer C, Kinzler K W, Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancers［J］. Nature, 1998, 396(6712): 643－649.
(1.大连医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，辽宁 大连 116011；2.吉林大学中日联谊医院耳鼻咽喉头颈外科，吉林 长春 130031)
