体外培养技术及其在头颈部鳞状细胞癌研究中的应用

　　　作者：蔡萍 作者单位：430060武汉大学人民医院

　　【关键词】 体外培养技术,头颈,鳞状细胞癌

　　头颈肿瘤占全身肿瘤的5%，其中90%是恶性肿瘤。头颈肿瘤具有独特的特征，如癌前病变易于识别;上气消化道(upper aerodigestive tract)肿瘤常位于体表，较易监测;流行病学资料显示能从肿瘤发生的部位和分期来预测局部和远处转移情况;原发肿瘤易复发并有继发其他部位肿瘤的危险性;另外，头颈部肿瘤是用化学药物预防肿瘤复发的理想模型。头颈肿瘤的这些特点决定了其在人体肿瘤研究中所具有的重要地位。当前，尽管头颈部鳞状细胞癌研究已取得重大进展，但随着研究的广泛和深入，出现愈来愈多待解决的问题。较多证据表明，体外培养技术的应用可望为头颈部鳞状细胞癌发生发展机制的阐明和防治带来新契机。本文将介绍这一领域的进展。

　　1 体外培养技术概述

　　体外培养(In Vitro culture)是指从体内取出组织或器官摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。包括细胞培养(Cell Culture) 、组织培养(Tissue Culture)和器官培养(Organ Culture)。组织培养和细胞培养并无严格区别。培养过程中，不论培养物是组织还是细胞都要生活在人工环境中，长期的培养易导致细胞趋向于变成单一类型细胞，组织培养最终成了细胞培养，而细胞在培养中的生命活动和在体内同样是相互依存的，呈现着一定“组织”特性。器官培养与前两者区别较大，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，它能保持体内同样的组织结构以及细胞类型的多样化。

　　细胞培养和器官培养各有优劣。细胞培养只是细胞体内状态的一种简单表现方式，每种细胞孤立于其他细胞而单独存在，大大减少了生物的复杂性，但细胞培养可大量繁殖细胞，便于进行大规模的实验研究。器官培养能维持细胞体内相似的结构整体性，允许同源和异源细胞共同存在，但器官培养只能维持组织的结构而不能使细胞增殖，限制了研究范围。三维培养系统(Three dimensional culture system)则兼并了以上两种培养方法的优势，既能表现组织的复杂性又能使细胞增殖，它使基于组织的检测方法如细胞生物学、生物化学以及分子生物学方面的研究得以进行，并能进行结构和功能的研究。在头颈部鳞状细胞癌的研究中，基于研究目的不同，上述各种培养方法均得到了适当运用，并相互补充。

　　2 头颈部鳞状细胞癌研究中的单层细胞培养技术

　　肿瘤研究的首要任务是明确致癌机制，致癌机制的明确是肿瘤治疗和预防的基础。基于结肠癌的FeronVogelstein模式，头颈部鳞状细胞癌临床演变过程可归结为两个阶段，即正常上气消化道黏膜经过一系列未知因素作用演变为癌前状态，癌前状态再经过一系列致癌因素作用转变为癌。细胞培养技术使我们能够清楚地认识正常上皮细胞、癌前病变细胞、生命有限的肿瘤细胞以及完全转化或永生化的肿瘤细胞的生物学特征，这些逐级进化的细胞是体外研究多阶段致癌机制的基础。

　　2.1 上气消化道正常上皮细胞的体外培养

　　上气消化道正常上皮细胞的培养最初主要是运用培养皮肤角原细胞的方法，采用无血清培养基和成纤维细胞滋养层技术。人颊黏膜、牙龈、口腔、口咽、鼻咽和喉咽等部位的上皮细胞在无血清培养基中均已培养成功，原代正常喉上皮细胞在无血清培养基中同样能够生存，且无血清培养基条件下生长的上气消化道上皮细胞能表现出其它部位上皮细胞相似的生物学特性。3T3成纤维细胞滋养层技术也被广泛运用于上气消化道上皮细胞的培养，但有些学者观察到经射线照射灭活的成纤维细胞仍显示出代谢活性，因此需排除这种代谢活性对实验结果的影响。近几年，在含血清的培养基中加入各种促细胞生长因子也能成功地进行上呼吸道、消化道上皮细胞的培养[1]。

　　正常上皮细胞体外培养难度较大且不能在体外长时间生存，因而限制了研究的长期性和连续性。为源源不断地得到正常上皮细胞，有的实验室摸索出了一种外植培养技术使正常上气消化道上皮细胞更易在无血清状态下生长[2]。首先将上气消化道黏膜接种于AmnioMax C100培养基中，随后将生长的上皮细胞传代到无血清KGM培养基中继续培养，用这种方法已成功地培养了多种上气消化道正常黏膜的组织标本，满足了科研的多种需要。

　　2.2 癌前病变细胞的体外培养

　　DOK是首次报道的能长期培养的上气消化道癌前病变细胞株[3]。该细胞株来源于一例高分化舌鳞癌邻近不典型增生的舌上皮，胰酶消化后接种于3T3成纤维细胞上，在含血清培养基中培养。DOK细胞株无致瘤性，无锚式独立性生长潜力，染色体为异倍体，分子技术显示它来源于不典型增生的黏膜而非播散的肿瘤细胞。在此之前，Rheinwald等运用外植技术培养增殖性红斑，建立了四种不同有限细胞系BICR E1、E2、E3和E4。Toma等进行了黏膜白斑的短期培养，培养过程中，高度增生与不典型增生的黏膜白斑混合在一起，细胞生长特性显示仅仅后者是潜在的癌前病变，与健康黏膜比较，克隆形成率较低，微核细胞增多。正常上气消化道上皮细胞不能在高钙含血清培养基中生长，而黏膜白斑细胞不仅能生长在低钙无血清培养基中，也能生长在高钙含血清培养基中。由此说明黏膜白斑细胞较正常上气消化道上皮细胞有着进化的表型。

　　Reppucci等进行了HPV感染的喉乳头瘤细胞的三维培养。原代细胞生长在胶原凝胶上，培养于高钙含血清培养基中，随后传代至无血清培养基KGM中，接种于由成纤维细胞包埋的胶原凝胶上，细胞在液气界面上生长，其中维甲酸的浓度可决定细胞是否形成分层的鳞状上皮或含纤毛细胞的柱状上皮，这种培养模式可用于检测HPV对细胞的生物学影响，如对细胞增殖、分化能力的改变，对生长因子的反应等。Burns等[4]通过滋养层技术也培养出两种喉乳头瘤细胞并对它们的生物学性状进行了检测。

　　通过外源性基因(如HPV16、SV40等)转染的方法获得的永生化口腔上皮细胞是一种实验来源的癌前细胞[5]。这种细胞为非致瘤细胞，仅仅生活在低钙培养基中，鉴于它们的永生化特性，被视为癌前细胞。当这些细胞接触致癌物后就能完全转化为肿瘤细胞，后者已失去了对钙的正常调节反应，能生长在高钙培养基中。由此，体外多步骤致癌机制模式得到初步建立。

　　2.3 头颈部鳞状细胞癌细胞的体外培养

　　从1985年建立第一个头颈部鳞状细胞癌细胞系起，已陆续建立了很多细胞系。有的效仿角原细胞培养法，采用滋养层技术以减轻体外的选择压力，有的运用异体移植技术，有的则在培养基中加入丰富的促生长因子以促进肿瘤细胞的生长[6]。头颈部肿瘤细胞系的建立使得在头颈肿瘤的抗肿瘤药物的筛选、免疫治疗、耐药性的研究以及肿瘤细胞膜表面抗原的研究等方面得以大规模进行。

　　细胞系用于研究的首要基础是能模拟临床状态，其中几个因素必须考虑。首先肿瘤具有异质性特征，其次细胞培养是一选择性过程，仅仅肿瘤组织块通过蛋白分解后能贴附的细胞或接种后能生长的细胞才具有在体外生长的潜力。还没有学者尝试过用不同的培养方法是否能建立同一细胞系，但很多研究显示头颈鳞状细胞癌细胞系与其来源的肿瘤细胞显示出很好的相关性，异体移植肿瘤的组织学与其来源的肿瘤组织学也相似。尽管细胞系的某些生物学性状具有不稳定性，但细胞系稳定的生物学特性也被许多学者认识。

　　除了建立细胞系外，肿瘤组织还能被分解为细胞悬液用于短期实验测试。分解后的肿瘤可用于检测肿瘤与宿主的相互关系;5～10天的培养可进行细胞遗传学分析[7];因获得单个细胞的细胞悬液困难，同时分解后的肿瘤克隆形成率低，因此基于克隆的化学敏感性测试受到限制，但如与胸腺嘧啶联合使用5天，就可解决克隆形成率低的问题[8];另外，使用CAM板还可进行放射敏感性测试[9]。肿瘤细胞是进行短期培养还是长期培养主要依据每个研究者的研究目的而定。

　　3 头颈部鳞状细胞癌研究中的移植/器官培养技术

　　肿瘤属于异质性组织结构，如肿瘤组织被修剪成毫米大小的微小组织块进行器官培养，因器官培养只能维持细胞，而不能繁殖，每一小块之间将具有不同的生物学特征，因而体外研究近似于体内。

　　口腔上皮的器官培养出现于1987年。在此之前，Sacks曾发现鼠和人器官培养中钙具有调节分化的作用，低钙条件下，黏膜的上几层能与基底层分离，此现象被应用于肿瘤侵袭能力的研究，以检测肿瘤与基底细胞的相互关系。此后，这种通过调节钙浓度去除基底层以上细胞的方法逐渐在细胞培养中得到广泛运用。既然人类上气消化道上皮细胞以多层形式生长，此技术同样运用于头颈部肿瘤的某些研究。

　　器官培养的出现使研究方向更广泛和深入。器官培养时辅以标记物可进行免疫组织化学的检测。凝胶支持的器官培养被用于头颈部肿瘤的化学敏感性测试[10]。口腔黏膜体外移植体可用于致癌药如亚硝胺等代谢能力的检测[11]。肿瘤组织体外异体移植(如裸鼠)后，因细胞活力增强，使头颈鳞状细胞癌细胞系的建立更容易。如将这种细胞进行细胞遗传学研究，能保证分析的是肿瘤细胞而非纤维样细胞。

　　器官培养能使样本维持体内同样的组织结构以及细胞类型的多样化，具有重要的应用价值。但这种培养方法也存在着一些技术问题，如营养和气体弥散的无效使培养样本的大小受到限制，克服这一技术难题可避免组织分解;同时，器官培养只能维持细胞，而不能繁殖，研究范围受到限制。

　　4 头颈部鳞状细胞癌研究中的三维培养技术

　　尽管移植/器官培养具有三维结构的复杂性，但它不能使细胞增殖。三维培养技术兼并了细胞培养和器官培养两种培养方法的优势，既能表现组织的复杂性又能繁殖细胞。多细胞肿瘤球体(Multicellular tumor spheroid MTS) 属于一种典型的三维培养系统，是某些细胞系在特定培养条件下形成的具有三维结构的多细胞聚集体，它在形态结构和生物学特性上都与动物模型和实体瘤类似，最初为放射和药物研究提供了一种介于单细胞与实体瘤之间的肿瘤实验模型，现已广泛应用于各种研究。这种培养模型中，悬浮的单个细胞可以聚集，这些聚集体有时直径达1mm以上，如头颈部鳞状细胞癌细胞株MDA886Ln曾被发现能在这种模型中聚集并以MTS形式生长，生长能力如同被研究的其它MTS株如V79和EMT6。因MTS能展示鳞状分化的形态学特征，故许多作者通过这种培养方式来检测维甲酸和干扰素等药物对细胞分化的影响，以观察其治疗作用[12]。通过这种培养方式还可建立肿瘤宿主的效应器模型，在这种模型中，Leu19+CD3淋巴细胞显示出调节细胞生长并摧毁MTS的作用[13]。来源于头颈鳞状细胞癌株PCI1和PCI50的MTS在免疫学研究中用于检测IL2激活的自然杀伤细胞的黏附、侵袭以及杀伤肿瘤的作用[14]。KB和Hep2两种细胞系形成的MTS用于化疗研究[15]，而Fadu和HN1形成的MTS除化疗研究外，还用于放疗研究[16]。结合当前的分子技术如原位杂交、PCR等，三维培养已在分子水平进行分析研究。

　　与MTS非常相似的另一种器官样培养模型已经得到发展。这种模型中，肿瘤细胞以高密度种植在滤膜上，细胞在液气界面培养，培养的细胞聚集形成三维结构，如同体内的组织结构。KpfMaier等[17]将下咽癌的这种模型用于化学药物敏感性的预测分析。

　　表皮细胞接种在胶原基质上，包埋于成纤维细胞中，然后被移向液气界面以便象体内一样由基底层获取营养，导致了筏式培养的诞生。经这种方法培养出的上皮细胞呈多层的三维样，如同皮肤样的表皮。同样，来自于正常喉粘膜、牙龈以及HPV感染的喉乳头状瘤可产生相似于体内的表皮。因此，运用这种培养模式，可区别正常喉上皮细胞和喉乳头瘤细胞，比较正常磨牙后口腔黏膜细胞及HPV转染的细胞[5]，以观察HPV感染导致的生物学结果。此外，这种方法还用于观察维甲酸调节细胞形态的潜能，EGF调节HPV感染的喉上皮的分化能力[18]。

　　5 问题及展望

　　总之，体外培养技术实现了对头颈部鳞状细胞癌进行大规模研究的可能，并使研究方向更加拓展。当然，体外培养技术作为一种技术，也有其不足，主要是组织和细胞离体后，独立生存在人工环境中，即使当前模拟体内技术发展很快，但与体内环境相比，仍有很大差异。因此在利用培养的肿瘤细胞做实验对象时，不能轻易把实验结果外推至体内。但体外培养技术仍在发展中，随着分子生物学、基因工程的不断发展和对肿瘤细胞认识的日益深入，体外培养技术将有更大的应用价值，最终成为恶性肿瘤以及人类其他疾病机制阐明和防治的有力武器。

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