诱生型一氧化氮合酶在肿瘤中表达的研究进展

　　　作者：高春梅 作者单位：050000 石家庄市，河北医科大学第二医院

　　【关键词】 iNOS，头颈肿瘤，NO

　　肿瘤的病理分级及其发生发展受肿瘤周围微环境中多种调控因子的影响。近年来，人们对一氧化氮(NO)与肿瘤生物学行为的研究中发现，NO及其限速酶——一氧化氮合酶(NOS)尤其是诱生型一氧化氮合酶(iNOS)在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。

　　1 iNOS 的结构、分型及其生物学特性

　　1.1 iNOS 的结构、分型 NOS是NO合成的限速酶，检测此酶可间接地反映NO的水平。NOS按其存在情况可分为构成型一氧化氮合酶(cNOS)和iNOS。cNOS又分为神经型(nNOS)和内皮型(eNOS);而按cDNA克隆时间先后又可分为NOS1，NOS2，NOS3，分别对应nNOS，iNOS，eNOS。其中eNOS和nNOS为钙依赖性，其活性受钙离子及钙调蛋白(CAM)浓度的调节，催化生成NO的浓度较低，主要在正常组织中表达，发挥正常的生理作用;而iNOS为非钙依赖性酶，在正常组织中很少表达，其主要存在于肥大细胞，巨噬细胞，中性粒细胞及各种肿瘤细胞中，多需在外源性物质如脂多糖(LPS)，炎性细胞因子(ILB、TNF、内毒素)以及缺血缺氧等损伤刺激后诱导产生，主要在细胞的胞浆内表达，催化生成NO 的浓度较高。

　　1.2 iNOS 的生物学特性 iNOS主要通过生成NO而发挥其生物学作用。iNOS的基因在各种有效因素的刺激下大量表达，合成蛋白后再催化NO的产生而对肿瘤产生影响。NO是目前在体内发现的最小、最轻、最简单的生物信使分子，由NOS催化L精氨酸( LArg)和分子氧反应生成。iNOS合成的NO 在肿瘤进展中起着双刃剑的作用，与肿瘤组织局部NO浓度、肿瘤类型和肿瘤细胞对NO 的敏感性有关。高浓度NO介导了巨噬细胞、内皮细胞的杀瘤作用。而存在于低水平NO 环境中的瘤细胞或对NO杀伤作用不敏感的瘤细胞则生存下来。通常在实质肿瘤微环境中产生的NO 浓度比引起细胞凋亡的浓度低1～2个数量级，这时肿瘤组织中的NO在肿瘤的进展中起促进作用[1]。NO主要通过以下方面促进肿瘤的进展：(1)促进肿瘤血管形成;(2)扩张肿瘤血管，改善肿瘤微循环;(3)抑制细胞凋亡，促进细胞增殖;(4)抑制宿主的抗肿瘤免疫反映;(5)诱导DNA损伤，导致基因突变[2][其机制主要有：激活核转录因子κB(NF κB)，引起DNA破坏同时抑制DNA 修复机制，最终导致DNA 损伤在增殖细胞中保存、扩散，激活癌基因，抑制凋亡等]。

　　2 iNOS同肿瘤相关细胞及相关因子的关系

　　2.1 iNOS 同巨噬细胞 巨噬细胞是机体免疫系统中重要成分之一，作为免疫效应细胞而起作用。吞噬病原体是巨噬细胞非特异性免疫功能的重要方面，在机体免疫防御过程中发挥积极的作用。大量的研究已证实活，化的巨噬细胞具有广谱的杀微生物作用，其细胞毒的效应分子也是多种多样，NO就是其中之一。巨噬细胞内有iNOS 参与的NO生成途径，TNF是较早发现的iNOS 激活剂，具有活化巨噬细胞的作用[3]。iNOS再正常生理情况下不表达，主要在巨噬细胞，中性粒细胞等被细胞因子激活后而产生，先表达iNOS的 mRNA 再生成iNOS从而诱导产生持续时间长而大量的NO。高水平的NO 对细胞主要发挥细胞毒性作用，NO有毒性，能抑制线粒体酶，如柠檬酸合成酶，乌头酸酶等。此外，NO 能与超氧阴离子产生一种氧化性很强的自由基——过氧亚硝酸盐(ONOO1)，这种自由基很不稳定，一旦进入靶细胞或临近细胞，将引起强烈的细胞毒作用，甚至损伤组织[4]。许波等[5]在小鼠腹腔原代巨噬细胞体外培养研究中发现，LPS可以在较低的浓度下(1 ng/ml) 诱导巨噬细胞iNOS mRNA的表达。

　　以往研究表明NO 对免疫功能的影响是多方面的，如杀灭细菌、真菌及寄生虫等病原体和瘤细胞等。高浓度的NO 抗肿瘤机制可能是NO 与瘤细胞代谢关键酶活性部位FeS 基团结合，形成铁亚硝酰基复合物，引起酶中铁的丢失，破坏DNA 合成限速酶,阻断肿瘤细胞的DNA 损伤修复、能量代谢。此外，NO供体或iNOS 的表达能够抑制某些肿瘤的蛋白合成，可能与始动因子eIF2a 的磷酸化和抑制80s 核糖体复合物的形成有关。

　　2.2 iNOS血管内皮生长因子(VEGF) 有研究表明，NO 主要在VEGF 介导的血管形成过程中发挥作用。VEGF 与受体结合后通过NO在细胞内进行信号转导而发挥作用。NO在VEGF介导的肿瘤血管形成的各个步骤：溶解基质、内皮细胞有丝分裂和迁移、新的血管网构建和管腔的形成中均起着重要作用。当用LNAME抑制NOS后，VEGF 促内皮细胞有丝分裂和迁移作用也被阻断。而且，VEGF 通过胞内信号转导途径可以增强NOS的表达，刺激产生NO。此外，肿瘤间质以出芽的形式形成新生血管前，首先出现的血管扩张也是由VEGF 的作用通过NO介导的，血管扩张使内皮细胞拉长伸展，增加其对内皮性分裂原的敏感性，然后在VEGF 指导下内皮细胞才能迁移和增生。因此NO可能是肿瘤血管形成的开关。也有研究发现NO通过增强VEGF 基因启动子的活性来增加VEGF 表达。另有报道肿瘤细胞生成的VEGF 可增加内皮细胞产生NO,可增加内皮细胞NOS 的活性[6]。佟书娟等[7]研究表明iNOS 和VEGF 在慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌组织中的表达均有显著相关性，说明iNOS 可能通过诱导VEGF 表达而促进胃癌血管形成，进而促进胃癌的生长，它们的协同作用可能在胃癌形成、发展中发挥了重要作用。同样在喉鳞状细胞癌演变过程中,VEGF与NO 之间也存在着相互依赖的正调控作用[8]，但其机制尚待进一步研究。

　　另外，最近学者研究发现，VEGFC可能与淋巴管生成有关。VEGFC属VEGF家族成员，主要通过其受体VEGFR2，VEGFR3发挥作用，是一种特异的血管、淋巴管内皮细胞调节因子。人类VEGFC基因定位于染色体4q54，相对分子质量21 kD，VEGFC是惟一能引起淋巴生成的因子，它通过激活VEGFR3诱导淋巴管内皮细胞有丝分裂，VEGFC也能通过其受体VEGFR2激活内皮细胞迁移，增加血管通透性，浓度增高时，还能引起血管内皮细胞增生，因此，VEGFC具有诱导淋巴管生成和血管生成的双重功能。但其主要功能为增强淋巴管内皮细胞的趋化性、细胞增殖和淋巴管的增加，包括管径的增大和数量的增加，因此亦称之为淋巴管内皮生长因子[9]。在人类实体肿瘤中，VEGFC的表达、肿瘤淋巴管生成或淋巴管数量和局部淋巴结转移间的相关性己有不少报道。提出了VEGFC可能通过影响淋巴管的数目、大小或改变现有淋巴管功能特性的可能性，或通过改变新形成的淋巴管内皮细胞的功能特性而有利于肿瘤细胞向淋巴管内渗透、转移[10]。

　　2.3 iNOS同HIF1a 缺氧诱导因子1a (HIF1a) 是近年发现的一种在缺氧条件下广泛存在于哺乳动物组织中的转录因子，由HIF1a和HIF1β两个亚单位组成，其中HIF1a对氧的依赖性较强，在调节肿瘤微环境氧的平衡中起重要作用，是HIF1的功能亚基。HIF1a一般在缺氧条件下激活表达，是调节缺氧反应性基因表达的共同分子通路。缺氧下HIF1a调控着40余种靶基因的表达,涉及血管形成、能量代谢、细胞增殖和存活等，均有利于肿瘤在缺氧条件下的能量代谢和氧的输送[11]。许多低氧反应性基因如iNOS的基因表达调控区，都有HIF1a的结合位点。Jung等[12]研究了体内和体外缺氧条件下的心肌细胞，发现iNOS基因增强子的DNA 序列中存在HIF1a的特异结合位点，在低氧条件下能够促进iNOS基因的表达，故认为HIF1a是iNOS基因转录活化的一个重要调节因子。Hierholzer等[13]也报道HIF1a能够上调缺氧性肺动脉高压大鼠及缺血性休克中iNOS基因的表达，从而参与发病。研究表明，HIF1 是缺氧条件下诱导iNOS 表达增加的主要转录调控因子[14]。王霞等[15]研究地鼠颊囊癌变过程中，黏膜上皮异常增生期间同时伴有明显的炎性反应，iNOS此时的过度表达可能主要由炎性介质诱导黏膜上皮和巨噬细胞产生。黏膜癌变后iNOS 持续高表达，可能与肿瘤局部微环境的缺氧状态诱导有关，是肿瘤对缺氧的适应反应，进一步通过促进肿瘤血管形成和促进细胞凋亡解决肿瘤缺氧。另外,研究还发现NO亦能够抑制HIF1a的转录活性，所以iNOS 可能通过NO 途径下调HIF1a的表达。高浓度NO诱导HIF1a稳定性可能参与机体病理生理过程，如炎症、变性和癌;而低浓度NO抑制HIF1a活性可能在生理情况下起调节作用。

　　3 iNOS 同其他肿瘤

　　3.1 Ichinoe等[16]的研究结果显示，iNOS 在胃癌中的表达较不典型增生组织明显升高，且与胃癌的大小、淋巴结转移相关，提示其在胃癌的发生、进展中具有重要作用。同时胃癌组织中iNOS阴性表达组的MVD明显低于阳性表达组，胃癌组织中iNOS 表达与MVD 相关，表明促进血管生成为iNOS 促进胃癌进展的机制之一。

　　3.2 Macchiarini等[17]发现iNOS可以作为评价肺癌分期预测转移风险的指标，随着肺癌病理分级的升高，iNOS的表达也相应增强。

　　3.3 Calvisi等[18]研究表明肝癌组织中有iNOS的高表达及MVD值的生高，二者呈正相关。 iNOS的表达及MVD值可以作为判断肝癌预后的重要指标。赵景山[19]检测60例肝癌组织及7例同期正常肝组织中iNOS的表达，结果显示肝癌组织中iNOS的阳性表达率为61.7%，癌旁组织和正常肝组织中未见其阳性表达，二者的表达率差异显著。且iNOS的表达与肝癌的发病年龄、性别、肿瘤大小、分期及甲胎蛋白(AFP)水平无关，而与肝癌的转移有关。

　　3.4 黄多美等[20]采用免疫组化法，测定了 55 例子宫内膜癌、24例不典型增生子宫内膜及 20 例正常子宫内膜中iNOS蛋白的表达情况，结果显示iNOS蛋白在子宫内膜癌中的表达明显高于正常子宫内膜及不典型增生子宫内膜中的表达，且与子宫内膜癌肌层浸润程度显著相关。这表明，子宫内膜癌患者iNOS的表达水平明显上调，其表达与子宫内膜癌的发生发展有关。

　　3.5 王爱春等[21]应用组织芯片及免疫组织化学技术检测12例正常脑组织、49例星形细胞反应性增生、49例低级别 (Ⅰ～Ⅱ级 )及 50例高级别 (Ⅲ～Ⅳ级 )星形胶质细胞瘤中 iNOS表达情况。结果显示，在正常脑组织中为阴性表达;从星形细胞反应性增生组到高级别星形细胞瘤组，阳性表达率均升高趋势，分别为：iNOS：28.89%(13/45)，57.75%(27/47)，81.63%(0/49);并且其在星形细胞反应性增生组及低级别星形胶质细胞瘤组中的表达差异显著。

　　但杜晓云等[22]却报道iNOS的表达强弱与食管癌的分化密切相关。赵茜等[23]在研究iNOS在乳腺癌中的表达及其与腋窝淋巴结转移的关系中也指出iNOS高表达与乳腺癌组织学分级和腋窝淋巴结转移关系密切。上述结果表明，iNOS 在各种肿瘤组织中均存在着高表达，iNOS能够促进各种肿瘤微血管的形成，同肿瘤的微血管密度值之间呈显著的正相关，但iNOS 同肿瘤的病理分级，分期，及肿瘤的分化程度是否有关在各种肿瘤中的报道不一。具体是各种不同肿瘤组织之间的差异造成，还是另有其他原因还有待于进一步研究证明。

　　由上可知，iNOS同肿瘤之间存在着密不可分的关系。iNOS对肿瘤的发生发展有着重要的影响，因此应用NOS的抑制剂可能成为肿瘤治疗的新热点，张俐等[24]研究表明，1 400 W通过选择性高效抑制iNOS,能够减轻或消除骨骼肌缺血再灌注损伤,且能平衡保持三大生命体征。李柏峰等[25]研究发现，选择性iNOS抑制剂氨基胍在大鼠胰腺缺血/再灌注中起到保护作用。张玉清等[26]研究，S甲基异硫脲SMT对大鼠实验性重症急性胰腺炎模型有较好的治疗效果。吴志勇等[27]研究表明，iNOS 基因治疗能增加肝内iNOS 的表达，使肝内NO 产量增加，肝窦舒张，从而降低肝内阻力和门静脉压力。进年，氨基胍作为iNOS的选择性抑制剂其特异性已得到广泛证实，它对iNOS的抑制活性比对eNOS和nNOS分别强500倍和50倍，而且急性毒性较低，虽然目前的研究尚限于短期应用，而且尚未应用于肿瘤治疗，但是从目前的研究成果来看,选择性高效iNOS抑制剂无疑是将来肿瘤治疗的一种理想用药,有一定的应用前景。

　　4 iNOS 同头颈肿瘤

　　NO及其合酶，特别是iNOS在鼻和喉的生理病理机制中特别是喉癌的发生机制中起到了重要的作用。研究表明，在头颈部鳞癌中，NOS活性高于正常组织或良性病变，且与病情进展呈正相关。栗子芳等[28]报道鼻息肉组织中NOS的活性明显高于正常鼻黏膜，且鼻息肉组织中NOS的活性主要由iNOS表达，并主要位于上皮细胞中。结果还显示，iNOS 除跟鼻息肉的形成机制密切相关外，还同慢性鼻窦炎及变应性鼻炎的发病机制有关系。

　　4.1 有研究表明，喉鳞状细胞癌组织中iNOS表达的阳性率明显高于正常组织，病理分化差者，阳性表达率增高，有淋巴结转移者阳性率也高于无淋巴结转移者[12]。杜晓东等[29]采用逆转录聚合酶链反应 (RTPCR)技术检测 40例不同病理分化程度、临床分期的喉鳞癌组织、癌旁组织及10例喉乳头状瘤、7例正常喉黏膜中iNOS mRNA的表达，结果喉癌组织iNOS mRNA阳性表达率较对照组癌旁组织、良性肿瘤组、正常人组明显增高,有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组,iNOS mRNA阳性表达与肿瘤原发部位及T分级无关,与细胞分化程度呈负相关。

　　4.2 Chen 等[30]研究口腔颌面部鳞状细胞癌的结果表明iNOS 主要由喉癌细胞表达，并与喉鳞状细胞癌的生长，发展和转移密切相关，iNOS 高表达的喉鳞状细胞癌的恶性程度高，易发生淋巴结转移。

　　4.3 对NOS在舌鳞癌组织中的表达及其与预后的关系的研究结果显示：在舌鳞癌组织中NOS1，NOS2，NOS3阳性率分别为30.9%，40%和38.2%。在有颈淋巴结转移组与无淋巴结转移组之间差异有非常显著性，NOS2在低分化，中分化和高分化之间，临床分期之间差异有显著性。认为舌鳞癌组织中NOS1，NOS2，NOS3的表达与其预后有关。NOS2对肿瘤的生长，分化，淋巴转移和预后均有重要作用[31]。

　　4.4 李德超等[32]选取15例腺样囊性癌病例，以10例瘤旁正常涎腺组织做对照。采用免疫组织化学方法检测每例病例中的iNOS和VEGF的表达，结果iNOS和VEGF在涎腺腺样囊性癌中的表达水平明显高于正常涎腺组织，两组之间有显著性差异(P<0.05)。两种因子之间的相互表达呈正相关。两种因子在腺样囊性癌中的表达与临床分期、淋巴结转移、病理分类密切相关，而与患者的年龄、性别、发病部位以及组织类型均无关。所以iNOS和VEGF与涎腺肿瘤的发生、发展中有密切关系,随肿瘤恶性程度增高而表达增强，而与患者年龄、性别、发病部位、组织类型均无关。

　　4.5 赵士芳等[33]检测口腔癌中iNOS 和VEGF 的表达及肿瘤血管密度(MVD) 的关系,结果发现在口腔癌组织中iNOS 高表达,且表达最强处大多位于肿瘤组织与周围组织交界处，iNOS 表达越高，MVD越大，提示iNOS可能通过促进口腔癌的微血管形成从而促进其生长转移，并参与VEGF 促血管形成作用。

　　4.6 Gallo等[34]对头颈部鳞癌研究结果表明NOS(eNOS 和iNOS)的表达均高于正常组织，有淋巴结转移的癌组织中iNOS 表达高于无转移者，血管密度也明显增高。认为NO 有促进肿瘤血管生成及肿瘤生长的作用。

　　但以上结果同Gavilanes等[35]报道的非钙依赖性总iNOS 活性在肿瘤早期较高的结果不一致。不一致的原因是样本例数相差较大的差异所造成还是其它别的什么原因有待于进一步的研究证明。

　　我们现在可以确定iNOS同喉癌的发生发展有着密不可分的关系，iNOS同肿瘤的MVD值存在着密切的关系， iNOS能够通过参与VEGF 促血管形成作用而影响喉癌周围的血管密度，从而影响喉癌的血供，因而临床上可通过iNOS 检测进行对异常增生的筛选和监控,也可以在肿瘤恶性前期特异阻断iNOS 的活性，以降低和抑制肿瘤的发生。

　　iNOS 有可能成为预防和治疗喉鳞状细胞癌的新的靶分子。iNOS通过其效应分子NO而发挥其生物学作用，设想人为调控肿瘤局部NO 的浓度就可能达到抗肿瘤的目的，应用特异性NOS 抑制剂(针对iNOS)来抑制肿瘤血管的形成，或用NO供体药物提高肿瘤内NO浓度来抑制其生长，并恰当地与手术，放疗，化疗，生物反应调节剂等结合运用，将为喉癌的防治开辟良好的前景。

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