颈椎间盘蛋白多糖聚合体的分布及其意义

作者：陈伯华

作者单位：青岛大学医学院附属医院骨科，山东 青岛 266003

    【摘要】  目的 探讨颈椎间盘蛋白多糖聚合体的分布及其意义。方法 本研究利用本室自行制备的透明质酸特异性荧光探针，运用探针杂交技术，观察蛋白多糖聚合体在胎儿、正常成年人病理颈椎间盘中不同的形态学分布。结果 蛋白多糖聚合体多分布在细胞表面胶原纤维间等特殊部位，其分布随年龄增加而逐渐减少。结论 蛋白多糖聚合体的合成随年龄的增加而减少，推测其可能为颈椎间盘退变的病因之一。

【关键词】  蛋白多糖聚合体 颈椎 椎间盘

    DISTRIBUTION OF THE PROTEOGLYCAN AGGREGATE IN HUMAN CERVICAL INTERVERTEBRAL DISCS AND ITS SIGNIFICANCESCHEN BOHUA, ZHENG HONGJUN, L ZHENHUA,  et al (Department of Orthopaedics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the distribution of proteoglycan aggregate in human cervical intervertebral discs and its clinical significance.  MethodsThe cervical intervertebral discs of fetal, normal adult, and adult with disk hernia were observed via a fluorscent probe to study the morphologic distribution of proteoglycan aggregate.ResultsProteoglycan aggregates were mostly found on the cellular surfaces and between the collage fibers in both anulus and nucleus regions. The distribution gradually decreased following the growing of the age. ConclusionThe synthesis of proteoglycan aggregate  decreases following the growing of the age, which is speculated that may be one of the causes of  cataplasia of intervertibral disc.

    ［KEY WORDS］proteoglycan aggregate; cervical vertebra; intervertebral disc

    颈椎间盘退变所致颈椎疾患系颈肩痛的常见疾患之一。有关腰椎间盘退变的基础研究较多［1～3］，而有关颈椎间盘的基础研究则不多。为此，本研究采用透明质酸荧光探针方法，对颈椎间盘细胞外间质蛋白多糖含量进行了分析。现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  样本来源

    1.1.1  胎儿椎间盘  正常流产胎儿1例，胎龄为33周。死后5 h内切取其C3,4～T1,2完整椎间盘，于清洁尼龙袋内贮存在液氮（-170 ℃）中备用。

    1.1.2  正常成年人椎间盘  颈椎外伤后手术的病人2例，男女各1例，年龄分别为54、38岁。外伤后24 h内手术，分别取出C4,5、C5,6椎间盘。贮存方法同胎儿椎间盘。

    1.1.3  病理椎间盘  颈椎椎间盘突出症病人3例，男2例，女1例；年龄34～56岁。手术取出C4，5椎间盘2例，C5，6椎间盘2例。取出的椎间盘30 min内液氮速冻，贮存方法同胎儿椎间盘。

    1.2  椎间盘组织冷冻切片的制备

    将冻存的椎间盘样本于使用前1 d切成5 μm厚的切片。胎儿与正常人椎间盘分成纤维环、髓核两部分切片，病理椎间盘每例为1张切片。切片后快速固定液固定，贮存于-20 ℃的冰箱中备用。

    1.3  蛋白多糖聚合体荧光探针的制备

    1.3.1  取材  生后2 d的小牛1只，颈动脉切开插管放血致死，死后1 h内取双侧肩胛软骨，剪成约0.5 cm×0.5 cm大小碎片，于无菌小玻璃瓶内贮存在液氮中备用。

  1.3.2  蛋白多糖的提取  将牛的肩胛软骨碎片与2倍体积的含蛋白酶抑制剂的4.0 mol/L盐酸胍缓冲液（pH 5.9）置于0 ℃下充分粉碎混匀，4 ℃下振荡90 h，然后以13 000 r/min离心45 min，上清液在4 ℃下对水透析24 h，换液，13 000 r/min离心透析30 min，取上清液真空冻干，-20 ℃贮存。依据HASCALL等［2］的方法，氯化铯密度梯度分离提取蛋白多糖单体、透明质酸和连接蛋白。真空冻干后密闭-20 ℃贮存。

    1.3.3  荧光探针液的制备  按文献［1］的方法。

    1.4  椎间盘冷冻组织切片的染色及观察

    以磷酸盐缓冲液充分冲洗组织切片，滤纸拭干。每张切片加100 μL探针液，37 ℃下孵育30 min， PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min。滤纸拭干后，迅速于荧光显微镜下观察，以相同的条件照相。

    2  结    果

    2.1  胎儿颈椎间盘蛋白多糖聚合体的分布

    胎儿颈椎间盘组织中有大量细胞成分，髓核中主要为脊索细胞，纤维环中存在大量的成纤维样细胞。荧光显微镜下，各节段髓核中的蛋白多糖聚合体主要分布在脊索细胞表面，与细胞形态一致。同时细胞间质中也存在着散在的蛋白多糖聚合体（图1a、1b、1c、1d）。纤维环中，蛋白多糖聚合体分布在成纤维样细胞的表面，细胞间质中有与纤维方向一致的散在的蛋白多糖聚合体（图2）。髓核纤维环交界处，两种形态的细胞表面都呈现较强的荧光。各不同节段的椎间盘中蛋白多糖聚合体分布以C4，5及C5，6稍多，但差异不明显。

    2.2  成人颈椎间盘蛋白多糖聚合体的分布

    椎间盘组织中细胞成分明显减少，尤其是髓核内，有关的脊索细胞不多，成纤维细胞稀少，蛋白多糖聚合体主要分布在细胞表面。细胞间质中蛋白多糖聚合体所呈现的荧光颗粒较胎儿每视野中的数量减少（图3a、3b）。纤维环中的蛋白多糖聚合体主要分布在胶原纤维之间，呈细丝状，走向与胶原纤维排列方向平行。存在于纤维环内的少量成纤维样细胞表面也分布着蛋白多糖聚合体（图4a、4b）。

    2.3  退变突出椎间盘中蛋白多糖聚合体的分布

    本文3例病理椎间盘中，残存的细胞组织间质中有极为少量的蛋白多糖聚合体存在（图5）。

    3  讨    论

    蛋白多糖作为细胞外间质的一种重要成分，具有重要的生理功能。蛋白多糖大多以聚合体的形式存在［4］，其对细胞外环境十分重要，如蛋白多糖不能聚集，就难以在细胞外间质中存留而流失。蛋白多糖以其核心蛋白上的透明质酸连接点连接于透明质酸［5］，这一连接具有高度特异性，尚未发现透明质酸与其他蛋白相连接。本实验利用这一特性，制备透明质酸荧光探针，来观察组织中的透明质酸与蛋白多糖聚合体的分布。

    目前，对于软骨外间质中的蛋白多糖的研究较多［6,7］。椎间盘组织中存在着大量的蛋白多糖，但不同的部位蛋白多糖的分布是不同的。髓核所含的蛋白多糖远高于纤维环，由纤维环外层到髓核中央，蛋白多糖的分布呈梯度增加，这在成人组织中表现更明显［8］。由于蛋白多糖单体与透明质酸形成聚合体的能力从纤维环到髓核是递减的，因而蛋白多糖聚合体在椎间盘中的分布没有明显的差异。这在本实验中得到了证实。

    在观察成人纤维环时发现，蛋白多糖聚合体与胶原纤维平行排列，这与椎间盘组织中蛋白多糖与胶原及弹性蛋白相互关系有关。蛋白多糖与胶原的连接在活体中对胶原纤维的聚集与排列有影响。同时，蛋白多糖聚合体与胶原纤维连接也可促进胶原的合成，从而影响椎间盘的结构与功能。

   蛋白多糖聚合体体积庞大，填充于胶原纤维之间，为组织提供了良好的水合空间，并维持胶原纤维所构成的椎间盘框架结构。由蛋白多糖所形成的渗透压、一定大小的有效孔径和在负载下椎间盘的静水压三方面共同作用，来控制水分进出，使之达到平衡，以适应椎间盘在负载或运动情况下的需要。蛋白多糖聚合体中的透明质酸可组织蛋白酶对核心蛋白的降解，延长蛋白多糖在组织中存在的时间。蛋白多糖聚合体还可阻止椎间盘基质钙化，使其富有弹性。因此，蛋白多糖聚合体在维持椎间盘生理功能以防止其退变方面可起到重要作用。

    本研究对蛋白多糖聚合体进行定位观察发现，椎间盘中蛋白多糖聚合体的分布随年龄的增加而减少。在胎儿，椎间盘组织中各种细胞的细胞表面及间质中均可见大量的蛋白多糖聚合体分布，在纤维环中，蛋白多糖聚合体的分布较髓核内稍多，但单位面积内数量差异不明显；而在成人，则蛋白多糖聚合体的分布稀疏，髓核中蛋白多糖聚合体的分布较纤维环更为稀少；病理椎间盘有极为少量的蛋白多糖聚合体存在。这与生化测定研究结果相吻合。这种变化，可能是由于连接蛋白功能的变化，或者聚合体降解为单体的增加，或对新合成单体聚合的抑制而造成的［9］。是椎间盘退变的发病因素之一。

    比较颈椎与腰椎间盘内蛋白多糖聚合体的分布，在胎儿颈椎髓核内的蛋白多糖聚合体的分布与腰椎基本相同，主要在细胞表面。数量上，颈椎明显多于腰椎，但单位面积内比较未见明显差异。成人腰椎间盘髓核内蛋白多糖聚合体多散在而细小，间质中分布较多。颈椎髓核内，仅仅分布于细胞表面，间质中十分稀少。在纤维环，则两者较为相似。病理椎间盘内，未见有细胞存在，间质中也未见有蛋白多糖聚合体的分布。有报道，颈椎由于承受高位的头部导致其单位面积的压力较其他节段明显为高，这与本研究结果胎儿颈椎椎间盘的蛋白多糖聚合体的分布较腰椎为多相一致，因为蛋白多糖聚合体对维持胶原纤维的框架、保持椎间盘的高度具有一定的生物力学意义。颈椎系脊柱中活动方位最大的节段，运动较腰椎明显为多，从而推测，成人的蛋白多糖聚合体的相对数量较多，这在研究中也得到证实。本研究还显示，髓核与纤维环中蛋白多糖聚合体的分布无明显差异，说明了正常情况下，椎间盘内髓核与纤维环的负荷较为平均，张力较为一致。随着人体的老化，椎间盘内细胞成分等的减少，蛋白多糖聚合体的数量及分布减少，从而引起椎间盘的生物力学特性变化，导致椎间盘退变的发生。

【参考文献】  ［1］胡有谷. 腰椎间盘突出症［M］. 第2版. 北京:人民卫生出版社， 1995:121130.

［2］HASCALL V C, HEINEGARD D K. Aggregate of cartilage proteoglycans Ⅱ. Oligosaccharide competitors of the proteoglycanhyaluronic acid interactions［J］. J Biol Chem, 1974,249：42424249.

［3］李玉瑞. 细胞外间质的生物化学研究方法［M］. 北京:人民卫生出版社, 1988:212214.

［4］BUCKWALTER J A, ROSENBERG L C. Electron microscopic studies of cartilage proteoglycans［J］. J Biol Chem, 1982，257(16):98309839.

［5］NEAME P J, BARRY F P. The link proteins［J］. EXS, 1994,70:5372

［6］BUCKWALTER J A, ROUGHIEY P J. Agerelated changes in cartilage proteoglycans: quantitative electron microscopic studies［J］. Microsi Res Tech， 1994,28(5):398408.

［7］ROUGHIEY P J, LEE E R. Cartilage proteoglycans: structure and potential functions［J］. Microsc Res Tsch, 1994,28(5):385397.

［8］ROBERTS S, CATERSON B , EISENSTEIN S M. Proteoglycan components of the intervertebral disc and cartilage endplate: an immunolocalization study of animal and human tissues［J］. Histochem J, 1994,26(5):402411.