快速老化鼠耳蜗的cDNA微阵列分析

　　作者：王宇声 雷爱军 杜波 作者单位：吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 通过比较年轻与年老的快速老化鼠(SAM)耳蜗中基因表达水平，筛选并分析可能的与老年性耳聋相关的基因。方法 将分别从年轻和年老的SAM耳蜗中提取的总RNA合成cDNA，并与载有1101个鼠基因的基因芯片进行杂交，杂交信号通过cyanine-3荧光显色，并使用微机对其图像进行分析。结果 虽然多数的基因在老年耳蜗中的表达并没有明显的变化，但是我们发现有3个基因的表达较年轻耳蜗中有明显的增加，他们分别是Brain factor-1，Single-minded-2和胸腺素 beta-4。结论 通过生物芯片技术，我们展示了老年鼠耳蜗中基因表达的情况，并发现三种mRNA的过表达有可能与老年性耳聋相关。这一研究为探讨老年性耳聋的分子生物学机制提供了基础。

　　【关键词】 快速老化鼠;老年性耳聋;生物芯片技术

　　老年性耳聋的病因与多种因素相关〔1～9〕。许多研究都表明，耳蜗是病变的主要部位。耳蜗的正常功能大约与100多种基因相关〔10〕。目前已经开始探索如何从基因的角度来解释老年性耳聋的机制。由于年龄是研究的主要因素，因此要花费很多年的时间来进行研究。此外，因为需要控制环境因素，即使对一个很小的家族进行连锁分析都是非常困难的。对快速老化鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)进行的听觉脑干电位和组织病理学研究证明，SAM小鼠是一种研究人类老年性耳聋的良好模型〔11〕。这种小鼠呈现不可逆的和递增性的柯蒂器的退行性改变。已知小鼠和人的耳聋具有很高的基因同源性。因此，我们利用高密度基因芯片低聚核苷酸分析技术，用SAM小鼠作为生物研究信息资源，来探索耳蜗中基因表达的模式。cDNA微阵列技术在医学领域多应用于肿瘤方面的研究，筛选可能的与肿瘤细胞分化、生长、转移相关的基因转录水平的变化，从中探讨肿瘤发生的机制，以及诊断、评估的指标，治疗的方法等。在老年性耳聋的研究方面的应用尚无相关的报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 总RNA的制备和扩增 分别从4只2个月的SAMP和4只20个月的SAMP小鼠中摘取耳蜗，各8耳，以提供足够的组织量，保证可以提取足够的总RNA。我们使用Trizol 试剂和RNeasy 微量试剂盒(Qiagen)，依据cDNA微阵列分析专用RNA提取手册提取总RNA。提取的总RNA通过使用Dnase I来消除可能存在的DNA污染。RNA的质量由Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer-Bio Sizing来进行检验。

　　RNA样品通过MessageAmp aRNA 试剂盒 (Ambion，Austin，美国)来进行扩增，为探针标记和杂交作准备。简要地说，用1 μg的总RNA以oligo(dT)为引物，进行T7扩增，并在体外进行转录反应生成反义RNA(aRNA)，以增加每个mRNA的拷贝数。这一实验方法已被广泛接受，并被证明这一过程不会改变每个mRNA在总体RNA中的含量。

　　1.2 探针标记和杂交 上一步生成的aRNA利用蓝色素 (Cy) 3 染色剂来进行标记，使用CyScribe First-Strand cDNA标记试剂盒。然后在65℃进行过夜杂交，并用于cDNA微阵列芯片(Atlas 小鼠玻璃芯片1.0)分析。

　　1.3 数据的分析 两张芯片由GenePix 4000A微阵列扫描仪 (Axon器械公司，加拿大) 来进行分析，所得到的图像由ArrayGauge软件进行处理。标记点的平均强度低于背景2倍以下的，将不做进一步的分析。

　　2 结果

　　本实验中应用的cDNA 微阵列芯片可以同时对1101个基因的mRNA进行分析。通过电脑对两张荧光图片进行分析，按照标记点的平均强度低于背景2倍以下视为阴性这一标准，我们得到三个比值在2以上的基因，其分别为Brain factor-1(U36760) 比值 2.15;Single-minded-2(U42554)比值 2.05 ;胸腺素(Thymosin)beta-4 (X16053)比值 2.24。以上括号内为相应的 Genebank ID。我们发现此3个基因的mRNA在老年鼠中较年轻鼠的表达增加。

　　3 讨论

　　3.1 老年性耳聋的研究进展 以往在探索老年性耳聋机理方面的研究中，多采用病理形态学、电生理等手段进行探讨，在老年性耳聋的基因分子生物学机制方面的研究并不多。目前主要的研究围绕线粒体DNA的大片段缺失与老年性耳聋的相关性来进行，国内外陆续都发表了相关的文章，也取得了一定的进展。我们首次利用生物芯片技术来进行老年性耳聋的研究，尝试比较老年小鼠与年轻小鼠耳蜗内，随着老化的发展，会有哪些基因的转录水平发生变化。

　　3.2 三个基因与老年性耳聋相关性分析 本研究的结果显示，在老年SAMP1的耳蜗中，有3个基因的mRNA较年轻的SAMP1表达明显增加，其他的基因并无明显变化。这三种mRNA分别是Brain factor-1，Single minded-2，Thymosin beta-4。

　　Brain factor-1 (BF-1)是一种winged-helix (WH)转录因子，在神经管中限制表达。在动物的胚胎中，BF-1表达于神经管上皮的祖细胞中，在成年动物的端脑，包括大脑皮质、海马回、嗅球、基底核等处均有表达。WH蛋白目前推测是一族与转录调节相关的蛋白，在动物的生长发育中可能有着各种各样的生理作用。其基因表达首先被发现在哺乳动物的肝脏中作为一种转录的激活因子，在果蝇属中与生长发育密切相关。目前在真核生物中共发现了100多个这一基因家族的成员，他们在序列和结构上都十分相似。除了知道其与生长发育相关外，其他还知之甚少。

　　Single-minded 2(SIM2)定位于人类染色体21q22.2，位于鼠类的16号染色体C3.3-C4带，被认为是一个重要的与先天愚型发病相关的基因。研究发现，在小鼠的类似病理模型中，其选择性的表达在早期胚胎的间脑中。人和小鼠的SIM2蛋白在结构上极为相似，都有一个helix-loop-helix(bHLH)区,两个Per-Arnt-Sim(PAS)和HIFIalpha-SIM-TRH(HST)区。SIM2在人类胚胎的肾脏和神经上皮中表达，而在啮齿动物中SIM2主要表达在胚胎或成年的中枢神经系统，软骨，肌肉和肾脏中。在小鼠的胚胎发育中，SIM2主要在间脑中表达。在最近的文献中报道，在转基因小鼠中过分表达的SIM2可以导致记忆和学习能力的下降，行为反常，痛觉障碍等。这些证据表明，其表达可能与Down氏综合症密切相关。

　　Thymosin beta-4是一种与肌动蛋白结合相关的多肽，是一种G-actin分离蛋白，在细胞骨架结构中具有重要的作用。Thymosin首次被从小牛的胸腺中提取出来，这些beta thymosin都具有G-actin分离作用，由于它们都具有相似的结构与功能，因此把它们都归类为beta thymosin家族。最近的研究发现，Thymosin beta-4还具有促进内皮细胞附着和移动的作用。此外，Thymosin beta-4的硫氧化物还有抑制炎症反应的作用。

　　就目前的文献，本研究发现的三种在老年鼠中表达增加的基因，没有与老化相关的报道，更没有与老年性耳聋相关的报道。因此有必要用其他实验手段进一步证实并深入探讨。

　　【参考文献】

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