缬沙坦对大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生和TLR4表达的影响

　　作者：杨简，江洪，陈思思，徐盛开，王继春 作者单位：武汉大学人民医院心内科，湖北 武汉 430060

　　【摘要】 目的：观察缬沙坦对大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生及Toll样受体4(toll like receptor 4, TLR4)表达的影响。方法：以1.5 F球囊导管建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，SD大鼠随机分为假手术组(n=6)、球囊损伤组(n=12)、缬沙坦组(n=12)。造模后第1天开始给予缬沙坦10 mg·kg-1·d-1灌胃，假手术组及球囊损伤组灌胃等量蒸馏水，14 d后取损伤血管段，组织形态学观察并测定内膜增生情况，实时定量PCR检测血管TLR4 mRNA的表达。结果：术后14 d，球囊损伤组和缬沙坦组可见明显内膜增生，内膜面积及内膜和中膜面积比均显著大于假手术组，而缬沙坦组上述指标均低于球囊损伤组(P<0.05);球囊损伤组和缬沙坦组TLR4 mRNA的表达较假手术组升高，与球囊损伤组比较，缬沙坦可降低球囊损伤诱导的TLR4高表达。结论：缬沙坦可抑制大鼠颈动脉球囊损伤引起的血管内膜增生，其作用可能是通过下调损伤血管TLR4的过表达而实现。

　　【关键词】 缬沙坦;内膜增生;球囊损伤;Toll样受体4

　　Effect of valsartan on neointimal hyperplasia and TLR4 expression in carotid artery of balloon injured rat

　　YANG Jian, JIANG Hong, CHEN Sisi, XU Shengkai, WANG Jichun

　　(Department of Cardiology, People's Hospital of Wuhan University Wuhan 430060, China)

　　[ABSTRACT] Objective: To investigate the effects of valsartan on neointimal hyperplasia and toll like receptor 4 (TLR4) expression of balloon injured rat carotid artery. Methods: Rat models of carotid artery injury were established with 1.5F balloon. SD rats were randomly divided into sham group (n=6), model group (n=12) and valsartan treatment group (10 mg·kg-1·d-1, n=12). All rats were sacrificed 14 days after injury, and the injured carotid arteries were harvested. Neointimal hyperplasia and TLR4 mRNA expression were determined by pathologic examination and quantitative realtime PCR, respectively. Results: On the 14th day after operation, obvious neointimal hyperplasia was observed in the model and valsartan treatment group. Compared with the model group, the neointimal area and intimal to media area ratio were significantly decreased in the valsartan treatment group (P<0.05). TLR4 mRNA expression was up-regulated in the model and valsartan treatment group. However, there was a significant decrease of TLR4 mRNA in the valsartan treatment group when compared to the model group. Conclusion: Valsartan may inhibit neointimal hyperplasia of rat carotid artery after balloon injury, which may relate to downregulation of TLR4 expression.

　　[KEY WORDS] Valsartan; Neointimal hyperplasia; Balloon injury; Toll like receptor 4

　　血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)过度增殖而引起的血管内膜增生及血管重塑，是动脉粥样硬化形成、血管成形术后再狭窄的主要原因，成为防治血管增生性病变的主要靶点[1]。Toll样受体4(toll like receptor 4, TLR4)作为天然免疫中的细胞跨膜受体，参与调节细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学功能[2]。缬沙坦除具有降压作用外，还可发挥改善心血管重构、保护血管内皮及抗炎等众多生物学效应[3]。目前有研究证实，缬沙坦可通过阻断TLR4信号转导通路，减轻或逆转心、脑、肾等靶器官损伤[4]。因此，本实验拟建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，观察缬沙坦对血管损伤后内膜增生和TLR4表达的影响，为该药的临床合理应用提供新的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　健康雄性SD大鼠30只，体重350～400 g，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心;1.5 mm × 20.0 mm球囊导管(Cordis公司);显微手术器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂);低分子肝素钠注射液(齐鲁制药有限公司);缬沙坦(北京诺华制药有限公司惠赠)。

　　1.2 大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立及分组

　　大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，取颈部正中切口，切开皮肤、筋膜，暴露左颈总动脉、颈外动静脉及颈内动脉。为避免急性血栓形成，球囊损伤前3 min经颈外静脉给予100 U/kg低分子肝素钠抗凝。用血管夹夹闭左颈总动脉近心端和颈外、颈内动脉远心端，临时阻断血流。在颈外动脉血管夹近心侧剪一斜形切口，将1.5 F球囊导管从颈外动脉切口逆行插入颈总动脉，直至距颈外动脉分叉处2.5 cm，向球囊内注入生理盐水充盈球囊，将球囊旋转并来回抽动，重复操作3次，以剥脱内膜。退出球囊，结扎颈外动脉，松开血管夹，恢复颈总至颈内动脉血流。缝合颈部切口，肌注青霉素20万单位以预防感染。实验分组：假手术组(n=6)、球囊损伤组(n=12)、缬沙坦组(n=12)。假手术组除不插入球囊导管外，其余操作同球囊损伤组。缬沙坦组造模后第1天起给予缬沙坦10 mg·kg-1·d-1灌胃，假手术组及球囊损伤组灌胃等量蒸馏水，14 d后处死动物，进行相关检测。

　　1.3 大鼠颈动脉内膜增生的观测

　　血管标本经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋。每段血管选取5个部位均匀切片(片厚4 μm)进行HE染色，在光镜下观察VSMCs的形态及内膜增生情况。采用ImagePro Plus 5.0专业图像分析软件测定血管内膜和中膜面积，并计算内膜和中膜面积比。

　　1.4 实时定量PCR检测TLR4 mRNA水平

　　总RNA的抽提与互补DNA(cDNA)的合成按照试剂盒说明书进行。本实验设定GAPDH为管家基因。TLR4和GAPDH引物参考Gene Bank(NM019178、NM017008)，采用Primer 5.0引物分析软件设计相应引物。TLR4引物序列：上游引物：5′AGCCATTGCTGCCAACATCA3′,下游引物：5′GCCAGAGCTACTCAGAAAC3′，扩增片断为148 bp;GAPDH引物序列，上游引物：5′GACAACTTTGGCTCG TGGA3′,下游引物：5′ATGCAGGGGTTCTGG3′,扩增片断为133 bp。各组TLR4 mRNA分别在荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR反应，ΔΔCt方法进行计算和统计。

　　1.5 统计学处理

　　所得数据采用SPSS13.0软件包进行统计学处理，计量资料以(±s)表示，组间比较用单因素方差分析和q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠颈动脉球囊损伤模型建立情况

　　30只大鼠共死亡2只，死亡率6.7%。死亡大鼠均发生于术中，其中因操作意外损伤颈外动脉大出血死亡1只，过量麻醉死亡1只。其余28只大鼠均造模成功。

　　2.2 缬沙坦对损伤血管内膜增生的影响

　　假手术组血管内壁光滑，颈动脉内膜仅见单层内皮细胞，内弹力膜完整。球囊损伤组和缬沙坦组均可见新生内膜增生，内弹力膜部分断裂。术后14 d，各组损伤血管中膜面积差异无统计学意义(P>0.05);球囊损伤组和缬沙坦组内膜面积、内膜和中膜面积比显著大于假手术组(P<0.05)。与球囊损伤组比较，缬沙坦组可明显减少血管内膜面积(0.145±0.012 vs 0.051±0.008,P<0.05)及内膜和中膜面积比(0.623±0.037 vs 0.178±0.041,P<0.05)，抑制损伤血管新生内膜的增厚。

　　2.3 缬沙坦对损伤血管组织TLR4 mRNA 表达的影响

　　与假手术组比较，球囊损伤组和缬沙坦组大鼠血管组织TLR4 mRNA的表达迅速上调。与球囊损伤组比较，缬沙坦治疗组使大鼠颈动脉组织TLR4 mRNA的表达水平下降了43.7%，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨论

　　TLRs是新近发现的与果蝇同源的人的Toll蛋白。TLR4作为第一个被发现的哺乳动物的Toll样受体，可通过识别不同病原体的病原相关的分子模式，激活下游信号转导途径，调控多种靶基因的表达，而在天然免疫防御中起重要作用[2]。有研究表明TLR4可分布于心肌细胞、内皮细胞等所有心血管细胞系;并指出其过度表达与动脉粥样硬化、再狭窄等血管增殖性疾病的发生有关[5，6]。由此可见，抑制其内源性TLR4的过度表达，有可能为防治再狭窄提供新的有效途径。

　　缬沙坦是临床上治疗高血压的一线药物，为高度选择性和特异性的AngⅡ1型受体拮抗剂，它能与ATl受体结合，阻断血管紧张素的生物学效应。近年来，因其在抗炎、抗氧化、内皮保护等方面具有显著疗效，越来越受到重视，临床应用的适应证也在逐步扩大[3，7]。最近有研究发现，缬沙坦预处理可以通过调控TLR4/NFkB信号转导途径，减轻心肌缺血再灌注损伤[8]。但是，目前对于缬沙坦在血管损伤后与再狭窄及TLR4表达的关系仍未见报道。

　　本研究结果显示，大鼠颈动脉球囊损伤后14 d即可出现明显的血管内膜增生，导致血管腔呈向心或偏心性狭窄，形成稳定可靠的大鼠颈动脉球囊损伤模型。给予缬沙坦治疗后内膜增生明显减轻，增生内膜面积、内膜和中膜面积比均显著减少。同时，缬沙坦还能抑制球囊损伤诱导的大鼠血管组织TLR4的高表达。因此，我们推测缬沙坦是通过下调大鼠损伤血管TLR4的过表达，从而来减轻球囊损伤引起的内膜增生，但其具体机制和临床有效性尚待进一步探索。

　　【参考文献】

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　　2 Takeda K, Kaisho T, Akira S. Tolllike receptors[J]. Annu Rev Immunol,2003,21:335376.

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　　4 Lv J, Jia R, Yang D, et al. Candesartan attenuates Angiotensin IIinduced mesangial cell apoptosis via TLR4/MyD88 pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,380:8186.

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　　8 Yang J, Jiang H, Yang J, et al. Valsartan preconditioning protects against myocardial ischemiareperfusion injury through TLR4/NFkappaB signaling pathway[J]. Mol Cell Biochem,2009,330:3946.