内毒素对离体鼻黏膜上皮细胞IFNγ、IL4表达的影响

　　作者：杨秀海，李源，高晓勤 作者单位：1.贵州省人民医院 耳鼻咽喉头颈外科,贵州 贵阳 550002; 2.中山大学第三医院 耳鼻咽喉头颈外科,广东 广州 510630;3.贵阳医学院 组织胚胎学教研室， 贵州 贵阳 550004 贵州省省长基金资助项目(20052A357)。

　　【摘要】 目的： 探讨内毒素(LPS)对鼻黏膜上皮细胞(HNEC) IFNγ、IL4表达的影响。方法: 设 LPS组、LPS+地塞米松(DXM)组、LPS+吡咯啉烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)组及生理盐水空白对照组。采用酶联免疫吸附及原位杂交方法检测培养上清液中IFNγ、IL4及HNEC内NFкB p50mRNA的表达，凝胶电泳迁移率检测NFкB p50，观察PDTC及DXM对NFкB p50活化抑制后IFNγ和IL4蛋白水平。结果: (1)0～100 μg/L LPS随浓度的增加，IFNγ分泌量增多;>100 μg/L后，IFNγ分泌量减少; 100 μg/L LPS刺激HNEC分泌IFNγ的作用最强。0～20 μg/L LPS随浓度的增加，IL4分泌量增多;>20 μg/L后，IFNγ分泌量减少; 20 μg/L LPS刺激HNEC分泌IL4的作用最强，40 μg/L LPS刺激 IFNγ和IL4的分泌有交叉，二者维持于一定的水平。(2)50 μg/L LPS刺激HNEC后随时间延长IFNγ分泌量逐渐增加，从4 h开始即有明显上升(P<0.05)，8 h达到峰值;IL4随时间延长分泌量逐渐增加，从2 h开始即有明显上升(P<0.05)，6 h达到峰值。(3)PDTC和DXM均抑制NFкB p50的表达和活性，减少HNEC分泌IFNγ和IL4,DXM 4.0 μg/L时,下降更明显,但高于此浓度时,不引起进一步的降低。结论: LPS对HNEC的刺激反应与浓度呈剂量依赖性，适当浓度的LPS刺激有利于HNEC分泌的Th1/Th2细胞因子维持平衡状态;过高或过低浓度的LPS刺激可诱导HNEC的Th1/Th2细胞因子失衡分泌，这可能是GNB在慢性鼻、鼻窦炎(CRS)的致病机理。

　　【关键词】 内毒素类; 上皮细胞; 鼻黏膜; 核因子кBp50; IFNγ; 白细胞介素4

　　The Effect of Endotoxin to Expression of IFNγ and IL4 in Human Nasal Epithelial Cell in vitro

　　YANG Xiuhai, LI Yuan, GAO Xiaoqin

　　1. Department of Otorhinolarynglogy and CephalicCervical Surgery, Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang 550002, Guizhou, China;

　　2. Department of Otorhinolarynglogy and CephalicCervical Surgery, The Third Affiliated

　　Hospital of Sun YatSen University, Guangzhou 510630, Guangdong, China;

　　3. Department of HistoEmbryology, Guiyang Medical college，Guiyang 550004，Guizhou, China;

　　[Abstract]Objective: To study the influence of endoutoxin (lipopolysaccharide, LPS) to expression of IFNγand IL4 in human nasal epithelial cell (HNEC). Methods: Cultured HNEC were divided into group LPS, group DXM, and group PDTC, that were added with LPS, LPS plus dexamethasone, and LPS plus pyrroline dithiocarbamate respectively. A blank control group (group B) was set up by adding normal saline. Expression of IFNγ and IL4 in supernatants of culture media and NFкB p50 mRNA expression in HNEC were detected with enzymelinked immune adsorption (ELISA) and hybridization in situ;The activation of NFкB p50 was detected by gel electrophoresis mobility analysis; The protein level changes of IFNγ and IL4 after the inhibition of PDTC and DXM to NFкB p50 was observed. Result: LPS could directly act on the HNEC to promote the secretions of IFNγ and IL4 in terms of time. The LPS excitement could significantly promote the activation of NFкB p50, which peaked in 3 hours and then went down. PDTC and DXM could significantly decrease analogically the secretions of IFNγ and IL4 and the activation of NFкB p50. Conclusions: The response of HNEC to the stimulation of LPS shows dosage dependence, and stimulation of LPS with suitable concentration benefits HNEC secreting Th1/Th2 cell factors to maintain the balance; The stimulation of LPS with too high and too low concentrations would cause unbalanced secretion of Th1/Th2 cell factors, which might be the pathopoiesis mechanism of gram negative bacilli in chronic rhinitis and rhinosinusitis.

　　[Key words]endotoxins; epithelial cells; nasal mucosa; nucler factorкB p50; IFNΥ; interleukin4

　　呼吸道上皮层是一个复杂的系统，由多种细胞共同协调各种功能，包括离子转运、黏蛋白产生、纤毛清洁和湿化等，这些功能对于维持呼吸道上皮层微环境至关重要[1]。Eisenbarth等[2]研究认为内毒素(LPS)的暴露水平与呼吸道炎症性疾病的发生和发展有密切的关系，本研究采用组织细胞培养技术在模拟体内环境下最大限度获得结构和功能上接近体细胞的大量鼻黏膜上皮细胞(human nasal epithelial cell, HNEC)，检测HNEC在不同浓度的LPS刺激下释放IFNγ和IL4蛋白水平、NFκBp50mRNA表达和活性，同时观察地塞米松(dexamethasone，DXM)对它们的影响，为慢性鼻炎及鼻窦炎的防治提供一定的实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 HNEC培养

　　经鼻内镜行鼻中隔偏曲矫正术中切除的正常下鼻甲黏膜组织30例，培养第2代冻存HNEC复苏后接种入预先放有原位杂交专用盖玻片的培养瓶中，使上皮细胞在瓶中的盖玻片上生长。台酚蓝染色，细胞活性(活细胞不着色)大于90%。培养3～4 d，经镜下观察上皮细胞有纤毛，有的呈杯状细胞样，细胞单层生长接近融合时，继续培养48 h。

　　1.1.2 主要试剂

　　人INFγ和IL4 ELISA试剂盒及小鼠抗人INFγ和IL4单克隆抗体购自深圳晶美公司，地高辛标记试剂盒为美国宝灵曼公司产品，PDTC为Sigma公司产品;NFκBp50原位杂交检测试剂盒、NFκBp50原位杂交试剂盒(探针序列为:5′CACCA TCAAGATCAA TGGCT ACACA GGACC 3′、5′TCTGG CAGCT GCCTC GGTGG GGATG AGATC 3′及5′ AAGAC TTCTC CTCCA TTGCG GACAT GGACT 3′)购自武汉博士德公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 分组

　　细胞生长至80%以上融合度时用于实验。(1) LPS组：①加入100 μg/L LPS 1 ml刺激细胞0、1、2、4、6、8 h;②分别以1、20、40、60、80、100、120、140 μg/L LPS 1 ml加人细胞1 h或6 h。 (2)LPS+DXM组：加入LPS的同时加入不同浓度的DXM 1 ml(1、2、4及6 μg/L);(3)LPS+PDTC组：加入LPS的同时加入1 μg/L PDTC 1 ml。(4)生理盐水1 ml为空白对照组。每组6个标本。

　　1.2.2 培养液ELISA抗体夹心法检测

　　至预定时相点离心收集培养液上清液50 μl，采用ELISA试剂盒检测IFNγ和IL4的蛋白水平。

　　1.2.3 NFκBp50mRNA原位核酸分子杂交(ISH)检测

　　HNEC接种于原位杂交专用硅化的盖玻片上至预定时相点，采用新鲜配制的4%(V/V)多聚甲醛室温固定30 min后，进行细胞片的漂洗及杂交。采用NFκBp50原位杂交试剂盒检测各组的NFκBp50mRNA表达水平。新鲜配制的0.5% H2O2/甲醛处理,灭活内源性过氧化物酶。蛋白酶K消化5 min,暴露mRNA核酸片段。互补脱氧核糖核酸双链探针变性后,滴加含地高辛标记探针的NFκBp50原位杂交液,湿盒中37 ℃杂交16～20 h。充分洗涤后,用免疫组化二氨基联苯胺盐酸盐法显示探针与培养的上皮细胞靶核酸形成的杂交体。以未加探针者及继蛋白酶K消化后用核糖核酸酶处理作为阴性对照。资料分析处理:在200倍视野下任意选取20个上皮细胞,用TJTY2300型全自动图像分析仪测定细胞内杂交产物的平均吸光度(A)值反映NFκBp50mRNA的表达水平。

　　1.2.4 凝胶电泳迁移率(EMSA)

　　参照文献[3]并略经修改，DNA-蛋白复合物经7 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶于150 V电泳3 h，真空负压加热干燥凝胶后，-70 ℃放射自显影。将显影结果经扫描仪输入计算机中，图像分析系统进行分析，以积分灰度值表示NFκB的活性变化。

　　1.2.5 活化抑制趋化实验

　　在刺激前30 min加入吡咯啉烷二硫代氨基甲酸盐(Pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)，然后与LPS共培养至预定时间，检验100 μg/L LPS刺激1 h组的NFκBp50活化及6 h组的INFγ和IL4的表达。

　　1.2.6 统计分析

　　数据以(x±s)表示，采用SPSS 13.0软件进行F检验和t检验。

　　2 结果

　　2.1 HE染色、细胞复苏培养

　　下鼻甲正常黏膜组织见图1。复苏的HNEC悬液在培养瓶中37 ℃培养24～48 h后细胞贴壁，呈鹅卵石状，细胞生长增生良好，随着时间增加，细胞越来越密集，贴壁的上皮片周围长出新的上皮细胞越来越多，细胞分化越来越好，培养6～8 d后，细胞增殖汇合成片。

　　2.2 NFkBp50mRNA的表达

　　LPS直接刺激诱导的HNEC NFкBp50mRNA阳性表达于胞质和(或)胞核中，呈现棕黄色细颗粒。空白对照组HNEC NFκBp50mRNA阳性表达微弱，以胞质为主，胞核表达量少，见图2;LPS诱导HNEC胞内NFкBp50mRNA的表达增强，以胞核为主，胞质表达量少，呈现NFкBp50mRNA胞浆中向核内转移，见图3。100 μg/L LPS刺激后从1 h开始即在胞浆中显示NFкBp50mRNA的强阳性表达，随作用时间延长，NFкBp50mRNA表达增加，至6 h达到高峰，胞浆中呈现密集的棕黄色细颗粒，8 h NFкBp50mRNA表达略有下降，NFΚBp50mRNA的表达随LPS刺激浓度的增加而增加。LPS+DXM组：NFкBp50mRNA表达量降低，胞核表达减少。

　　2.3 IFNγ和IL4

　　不同浓度的LPS对IFNγ和IL4的影响见图4。50 μg/L LPS组： (1)随时间延长IFNγ分泌量逐渐增加，从4 h开始即有明显上升(P<0.05)，8 h达到峰值;(2)随时间延长IL4分泌量逐渐增加，从2 h开始即有明显上升(P<0.05)，6 h达到峰值。见图5。LPS+DXM组：IFNγ和IL4表达水平下降,DXM 4.0 μg/L时,下降更为明显,但高于此浓度时,不引起更进一步的降低。

　　2.4 LPS对NFκB活化的影响

　　EMSA结果显示，不同浓度的LPS刺激HNEC后NFкBp50活性增强，0～100 μg/L呈量变正相关，>100 μg/L呈抑制状态，100 μg/L对其刺激作用最强(见图6)。100 μg/L LPS刺激HNEC 3 h，NFкBp50发生显著性的转核活化，1 h达到高峰，然后开始下降，8 h已处于低水平的维持状态，且在0～3 h，NFкBp50的活化随LPS的刺激剂量增加而增加,LPS+DXM组NFкBp50mRNA活性降低。见图7。

　　2.5 PDTC对NFκBP50 IFNγ和IL4影响

　　与对照组相比，1 μg/L PDTC对100 μg/L LPS刺激1 h，NFκBP50的活化显著抑制(P<0.01，见图8)，且PDTC抑制NFκBP50活化后，50 μg/L LPS诱导6 h组IFNγ和IL4的分泌均显著下降(P<0.01)，见图9。

　　3 讨论

　　上呼吸道慢性炎症性疾病的病因复杂，发病过程中有多种免疫细胞、炎性细胞及细胞因子参与。Lee[4]和Dellacono等[5]研究发现，在慢性炎性鼻黏膜组织中有IFNγ和IL4蛋白的表达，而且IFNγ和IL4的比例与鼻黏膜的Th1/Th2炎症反应类型具有明显的相关性。为了探讨革兰阴性杆菌在鼻黏膜炎性反应中的作用，采用不同浓度的LPS刺激离体培养的HNEC 6 h后检测IL4和IFNγ的蛋白水平。高浓度的LPS刺激细胞产生IFNγ，可能促使机体发生Th1反应，抑制Th2反应的发生和发展;而低浓度的LPS刺激细胞产生IL4，可能促使机体发生Th2反应，抑制Th1反应的发生和发展。过高浓度的LPS对HNEC可能造成毒性损伤，细胞功能降低。研究结果显示，在40 μg/L LPS刺激HNEC分泌IFNγ和IL4的曲线有交叉，二者维持于一定的水平。所以，维持鼻腔内正常的菌群，鼻黏膜接受一定浓度的LPS刺激，有利于鼻黏膜上皮细胞保持正常的生理功能。

　　LPS是较为常见的致炎因子，LPS被TLR4以胞外LRR识别后,通过其胞浆TIR域跨膜信号转导,主要经MyD88/IRAK/ TRAF6/ NFκB信号通路激活靶细胞,从而引起一系列免疫应答。一方面,通过产生活性氧和氮中间体以及各种抗菌肽,直接杀灭病原微生物;另一方面,通过分泌细胞因子、趋化因子、黏附分子和急性期蛋白,参与炎症和早期宿主防御[6]。糖皮质激素由于对CRS疗效显著而倍受鼻科学界关注。本实验结果显示，LPS刺激后能明显地诱导核转录因子NFΚBp50mRNA的蛋白表达和活性增加，DXM能抑制其表达水平及救助失衡的Th1/Th2型细胞因子IFNγ和IL4蛋白水平。现已证实抗氧化剂PDTC能通过阻止IκB的降解，有效抑制调控炎症反应的转录因子NFkB的活性[7]，LPS+PDTC组结果显示，PDTC选择性抑制NFκB的表达和活性，与DXM的实验效应类似。因此，认为NFκBp50在LPS刺激HNEC产生Th1/Th2型细胞因子过程中可能起着重要的作用，DXM可能通过NFκBp50抑制Th1/Th2型细胞因子的大量产生，调整Th1/Th2，减轻LPS导致的鼻黏膜炎症反应。Hajime[8]和Auphan等[9]研究认为，DXM由胞液的糖皮质激素受体介导，与配体结合后易位进入胞核参与基因表达调整，刺激MAD3基因翻译产生IκB和NFκB 结合,阻碍NFκB进入细胞核参与活化多种致炎因子的转录和翻译，减少鼻黏膜内皮细胞、上皮细胞、副交感神经元和炎症细胞合成Th1/Th2型细胞因子,抑制由Th1/Th2型细胞因子引起的血管扩张和腺体分泌，一定程度解释临床吸入皮质类固醇激素能有效地控制气道炎症的机理，至少部分抑制细胞因子激活的气道上皮细胞的IL4和IFNγ的产生。DXM能在转录水平上抑制Th1和Th2细胞因子的产生,缓解鼻部疾病的各种症状，这一结论为DXM在临床的进一步治疗作用提供了理论参考。

　　【参考文献】

　　[1]Farmer SG. The airway epithelium as a barrier and as a modulator of smooth muscle function[J].Pharmacol Toxicol ,1993(3):32.

　　[2]Eisenbarth SC.Dependent T helper cell type responses to inhaled antigen[J].J Exp Med, 2002 (12) :1645-1651.

　　[3]Sugita S, Kohno T, Yamanoto K，et al. Induction of macrophageinflammatory protion3 alpha gene expression by TNFdependent NFKappa B action [J]. J Immunal, 2000 (11): 152-156.

　　[4]Lee CH , Rhee CS , Min YG. Cytokine gene expression in nasal polyps[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1998(8):665 -670.

　　[5]Dellacono FR, Eisma R, Lafreniere D，et al. Interferon gama expression in human nasal polyps [ J ]. Laryngoscope, 1997(5):626-630.

　　[6]Kirsten Siepmann, Sabine Biester, Jarmila Plková，et al. CD4+CD25+ T regulatory cells induced by LPSactivated bone marrow dendritic cells suppress experimental autoimmune uveoretinitis in vivo[J].Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol,2007(2):221-229.

　　[7]Hajime I , Kazuhiko T, Chikako K，et al. Effects of dexamethasone on mucin gene expression in cultured human nasal epithelial cells[J].Laryngoscope, 2002(8Pt1):1436-1440.

　　[8]Auphan N, DiDonato JA, Rosette C，et al. Immunosuppression by IκB synthesis[J].Science, 1995 (5234):286-290.

　　[9]Zhang G,Ghosh S. Toll like receptor mediated NFκB activation: a phylogenetically conserved paradigm in innate immunity[J].J Clin Invest, 2001(1):13-19.