低氧条件下人参皂甙Rg3诱导人喉鳞癌细胞凋亡及对HIF1α和VEGF表达的影响

    作者：宋冬梅，张丽莎，王宝山，张继华    作者单位：石家庄，河北医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科     【摘要】  目的 研究人参皂甙Rg3对低氧条件下人喉鳞癌细胞（Hep2）生长抑制作用以及可能的机制。方法 通过体外低氧培养Hep2人喉鳞癌细胞株，同时设立阴性对照组，阳性对照组（顺铂）；采用TUNEL法 (终末脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记)检测细胞凋亡情况，计数凋亡细胞,计算凋亡率；流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡情况；应用免疫细胞化学技术和流式细胞技术检测Hep2细胞在人参皂甙Rg3作用下HIF1α和VEGF蛋白表达的变化；应用RTPCR技术检测HIF1α和VEGF mRNA表达的变化。结果 TUNEL及流式细胞术检测Rg3组的凋亡率明显高于阴性对照组(P<0.05)；在低氧条件下，Rg3组和顺铂对照组的Hep2细胞中的HIF1α和VEGF蛋白表达低于阴性对照组（P<0.05）；Rg3组的HIF1α和VEGF mRNA水平明显低于阴性对照组（P<0.05），顺铂组的HIF1α和VEGF mRNA水平无明显变化。结论 低氧条件下，人参皂甙Rg3诱导细胞凋亡，抑制了Hep2细胞中的HIF1α和VEGF蛋白和mRNA的表达，这可能是Rg3抗肿瘤作用的机制之一。

    【关键词】  人参皂甙Rg3；低氧；HIF1α；VEGF

     Effect of Gensenoside Rg3 on Apoptosis and Expression of HIF1α and VEGF in Hep2 Human Laryngeal Cancer Cell Line under Anoxic Conditions

    SONG Dongmei ，ZHANG Lisha，WANG Baoshan，ZHANG Jihua

    Department of OtolaryngologyHead and Neck Surgery,The First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, China

    Corresponding  Author: WANG Baoshan，Email:wangbaoshanent@yahoo.com.cnAbstract：Objective   To study the mechanism and effect of gensenoside Rg3 on Hep2 Cell Line during the normoxia and hypoxia.Methods  Anoxic cultured Hep2 human laryngeal cancer cell line, meanwhile the normal control group and positive control group (DDP)were set.The cell apoptotic was detected by TUNEL method.The cell cycle and cell apoptosis analysis was detected by FCM.Then the expression of HIF1α and VEGF protein was detected by immunohistochemistry and flow cytometry;the expression of HIF1α and VEGF mRNA was detected by transcriptionpolymerase chain reaction(RTPCR).Results  The apoptosis rate obviously increase by TUNEL and FCM(P<0.05).Compared with the Hep2 cells without any induction, the expression of HIF1α and VEGF protein in Rg3 groups and DDP groups obviously depressed(P<0.05);the expression of HIF1α and VEGF mRNA in Rg3 groups obviously depressed(P<0.05);but had no effect on the level of HIF1α and VEGF mRNA  in DDP groups.ConclusionRg3 could inhibit the high protein and mRNA  expression of HIF1α and VEGF and it could induce cell apoptosis under anoxic conditions,which may be one of its anticancer mechanisms.

    Key words：Gensenoside Rg3； Anoxic； HIF1α； VEGF

    低氧是实体瘤微环境的基本特征之一，而在低氧过程中肿瘤细胞是通过特异性转录因子——缺氧诱导因子1α（HIF1α）过表达来维持氧和代谢的稳定,促进自身生长和转移。HIF1α是肿瘤适应低氧环境并诱导低氧相关基因表达，以克服低氧这一不利因素的中心环节，它通过对内源性血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促红细胞生成素（EPO）等一系列靶基因的调控，发挥作用[1]。人参皂甙Rg3是从人参(ginseng)根的浸出液中分离出的一种有效成分，目前的研究表明人参皂甙Rg3可以通过诱导肿瘤细胞凋亡[2]、抑制肿瘤血管生成因子(主要是VEGF)的信号传导[3]等途径起到抗肿瘤作用。为了解Rg3对头颈鳞癌的作用及机制，本文探讨低氧条件下人参皂甙Rg3对人喉鳞癌细胞凋亡的诱导以及对HIF1α和VEGF表达的影响。

    1  材料与方法

    1.1  试剂和仪器

    人参皂甙Rg3购于中国药品生物制品检定所，批号：110804200301，纯度98%，二甲基亚砜（DMSO）助溶后抽滤除菌，-20℃保存备用。DMSO ，SERVA公司。RPMI1640培养基，CELLGRO公司。HIF1α和VEGF多克隆抗体。PV试剂盒，北京中杉生物公司。小牛血清，杭州四季青生物材料研究所。总RNA提取试剂。第一链合成cDNA试剂盒，Fermentas公司。扩增试剂盒GoTaq Green Master Mix，Promega公司。上下游引物，北京奥科生物公司。CO2培养箱，日本三洋公司MC0175。倒置式显微镜，日本奥林巴斯CXPC2。FACSort 流式细胞仪，美国BD公司。GeneAmp PCR system 9600 ，美国Perkin Elmer。凝胶成像分析系统 GDS8000，美国UVP公司。

    1.2  低氧条件设置

    设立低氧条件为37℃，5%CO2,1%O2,94%N2。建立体积分数为5%CO2,1%O2,94%N2的有机玻璃通气槽，维持一定湿度,密封后37℃培养箱培养。

    1.3  细胞分组及培养

    人喉鳞癌细胞Hep2培养于含10%小牛血清，青霉素（100u/ml）链霉素（100μg/ml）的1640培养基中，置于37℃，5%CO2,20%O2的培养箱，待细胞进入对数生长期后，分为A～F6组进行实验（A常氧对照组,B常氧Rg3组,C常氧顺铂组,D低氧对照组,E低氧Rg3组,F低氧顺铂组）。

    1.4  方法

    1.4.1  TUNEL法检测细胞凋亡

    Hep2细胞经胰蛋白酶消化,接种于24孔板中的无菌盖玻片上，常氧培养24h细胞达80%汇合后，A、D组各加入100μl培养液,B、E组各加入含Rg3的培养液100μl（终浓度为300μg/ml）,C、F组各加入含顺铂的培养液100μl（终浓度为3μg/ml），各对照组中均含有与Rg3组浓度相同的DMSO。A、B、C组常氧条件下，D、E、F组低氧条件下培养24h，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定10min，0.01MPBS冲洗三次，晾干备用。按照TUNEL试剂盒说明书操作,对细胞爬片进行处理,细胞核染成棕褐色者为凋亡细胞,核蓝色者为阴性。

    1.4.2  流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡

    Hep2细胞经胰蛋白酶消化传代，常氧培养24h细胞达80%汇合后，A、D组加5ml常规培养液，B、E组加入含Rg3（终浓度为300μg/ml）的培养液5ml,C、F组各加入含顺铂（终浓度为3μg/ml）的培养液5ml，各对照组中均含有与Rg3组浓度相同的DMSO。 A、B、C组常氧条件下， D、E、,F组低氧条件下培养24h，胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液,于预冷的75%酒精固定10min，4℃保存备用。常规流式免疫标记后，应用流式细胞仪进行检测。以 488nm 氩离子激光激发， 应用 Ｅｘｐｏ ３２ ＡＤＣ软件进行免疫荧光数据分析。

    1.4.3  免疫细胞化学检测HIF1α和VEGF蛋白的表达

    Hep2 细胞经胰蛋白酶消化,接种于24孔板中的无菌盖玻片上，常氧培养24h细胞达80%汇合后，A、D组各加入100μl培养液,B、E组各加入含Rg3的培养液100μl（终浓度为300μg/ml）,C、F组各加入含顺铂的培养液100μl（终浓度为3μg/ml），各对照组中均含有与Rg3组浓度相同的DMSO。A、B、C组常氧条件下， D、E、F组低氧条件下培养24h，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定10min，0.01MPBS冲洗三次，晾干备用，免疫染色。用兔抗人HIF1α和VEGF多克隆抗体通过PV法进行免疫细胞化学染色（稀释度分别为1∶70，1∶25）。用已知阳性切片作阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照。光镜下观察到细胞胞浆存在棕黄色颗粒为Hep2阳性。〔光镜下随机选择5个视野（×400）。（1）无染色记为0，弱染色（浅黄色）记为1，中等染色（棕黄色）记为2，强染色（黄褐色）记为3；（2）阳性细胞<5%记为0，阳性细胞5%～25%记为1，阳性细胞25%～50%记为2，阳性细胞>50%记为3。（1）（2）两项结果相加结果为0，代表阴性（-）；1～2，（+）；3～4，（++）；5～6，（+++）〕。

    1.4.4  流式细胞术测定HIF1α和VEGF蛋白的表达

    Hep2 细胞经胰蛋白酶消化传代，常氧培养24h细胞达80%汇合后，A、D组加5ml培养液，B、E组加入含Rg3（终浓度为300μg/ml）培养液5ml, C、F组各加入含顺铂（终浓度为3μg/ml）培养液5ml，各对照组中均含有与Rg3组浓度相同的DMSO。 A、B、C组常氧条件下， D、E、F组低氧条件下培养24h，胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液,于预冷的75%酒精固定，4℃下保存在冰箱里备用，常规免疫染色后，应用流式细胞仪进行检测。以488ｎｍ氩离子激光激发， 应用 Ｅｘｐｏ ３２ ＡＤＣ软件进行免疫荧光数据分析。

    1.4.5  RTPCR检测HIF1α和VEGF mRNA的表达

    用Trizol提取总RNA,紫外分光光度计测样品浓度,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,用MMLV第一链cDNA合成试剂盒反转录合cDNA取反转录产物2μl行PCR反应。

    HIF1α引物为：上游5′TTGATTGCATCTCCATCTCCT3′，下游5′TTCGCTTTCTCTGAGCATTCT3′,产物大小250bp，退火温度55.7℃;VEGF引物为：上游5′CGAGACCCTGGTGGACATCT3′，下游5′ACAAATGCTTTCTCCGCTCT G3′产物大小296bp，退火温度57.7℃;内参照βactin引物为：上游 5′GGG AAA TCG TGC GTG ACAT 3′，下游5′TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3′，产物大小385bp，退火温度57℃。反应条件:94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸1min,32个循环,最后72℃延伸10min。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶图像分析系统分析,以目的基因与βactin mRNA电泳带的荧光强度比值作为目的基因的相对表达量。

    1.5  统计学方法

    应用 SAS6.12统计软件进行处理, 数据以±s表示, 组间比较用t检验和χ2检验。

    2  结果

    2.1  TUNEL标记结果

    对照组呈淡蓝色多角形，凋亡细胞极少；用药组可见大量凋亡细胞，呈褐色,细胞圆形或梭形，凋亡细胞的胞核经TUNEL染色呈棕褐色,核固缩,染色质凝集成块或边集，见图1。

    2.2  流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡

    2.2.1  人参皂甙Rg3对细胞周期时相的影响

    在常氧、低氧条件下，Rg3组G0/G1期细胞比率较对照组增加，S期细胞比率下降，且Rg3组增殖指数较对照组降低(P<0.05) ，见表1、图2。

    2.2.2  人参皂甙Rg3对细胞凋亡率的影响

    在常氧、低氧条件下，Rg3组凋亡率较对照组增加 (P<0.05) ，见表1、图3。

    2.3  免疫细胞化学检测HIF1α和VEGF蛋白的表达结果

    各组细胞中HIF1α和VEGF蛋白均有不同程度的表达，为胞质内棕黄色粗细不均匀颗粒,核周表达最为明显，其中低氧对照组表达最强，棕黄色颗粒着色明显加深。低氧条件下，HIF1α和VEGF蛋白的表达明显高于常氧组；用药组HIF1α和VEGF蛋白的表达弱于对照组（P<0.05）。Rg3组与顺铂对照组之间无显著差异（P>0.05），见表2、图4、5。表1  人参皂甙Rg3对细胞周期时相的影响

    采用方差分析,与A组比较，*：P<0.05；与 D组比较，#：P<0.05表2  各组细胞中HIF1α和VEGF蛋白的表达

    分组ABCDEF蛋白表达 +++++++++++

    2.4  流式细胞化学检测HIF1α和VEGF蛋白的表达结果

    低氧条件下，HIF1α和VEGF蛋白的表达明显高于常氧；用药组HIF1α和VEGF蛋白的表达弱于对照组（P<0.05）。Rg3组与顺铂对照组之间无显著差异（P>0.05），见表3。与免疫细胞化学结果一致。表3  Rg3对HIF1α和VEGF蛋白的表达的影响

    组别/吸光度值HIF1αVEGFA1.61±0.1051.82±0.076B1.17±0.008*1.48±0.015*C1.16±0.019*1.49±0.025*D3.24±0.243*3.82±0.072*E2.59±0.188#2.51±0.095#F2.54±0.42#2.49±0.089#

    *：与A组相比，P<0.05；#：与D组相比，P<0.052.5  RTPCR结果检测HIF1α和VEGF mRNA的表达

    低氧条件下， HIF1α和VEGF mRNA水平的表达明显高于常氧条件。Rg3组降低了HIF1α和VEGF mRNA水平的表达（P<0.05），顺铂组与对照组之间差异不显著（P>0.05），见表4，电泳结果见图6、7。

    2.6  相关性分析

    经相关性统计分析， HIF1α和VEGF蛋白的表达呈正相关。（相关系数r=0.8928，P=0.0166）; HIF1α和VEGFmRNA的表达也呈正相关（相关系数r=0.9891，P=0.0002）。 表4  Rg3对HIF1α和VEGF mRNA表达水平的影响

    3  讨论

    目前研究广泛证实，低氧是实体瘤微环境的基本特征之一，肿瘤形成过程中一个关键的步骤就是肿瘤细胞对低氧的适应，其中缺氧诱导因子1α是肿瘤适应低氧环境并诱导低氧相关基因表达，以克服低氧这一不利因素的中心环节。HIF1α通过对促红细胞生成素和血管内皮细胞生长因子等靶基因的调控，发挥作用 [3]。随着肿瘤的不断生长、体积增大，部分血供不足发生缺氧坏死,并诱导HIF1α过度表达。而HIF1α能增强其下游靶基因VEGF的表达,活化的HIF1α与靶基因上的HIF1α结合位点结合,形成转录起始复合物,从而启动靶基因转录和相应的蛋白产物增加,VEGF表达增加,VEGF进而作用于血管内皮细胞表面的血管内皮生长因子受体VEGFR1和VEGFR2,从而激活了一系列的缺氧转导通路,诱导新血管的生成，促进肿瘤的生长。

    本文研究了常氧、低氧条件下，人喉鳞癌细胞HIF1α和VEGF表达的变化。结果显示：低氧条件下，HIF1α和VEGF蛋白的表达明显高于常氧，证实了低氧促进了HIF1α，从而增加VEGF的mRNA稳定性以及VEGF的转录活性与本实验组前期实验结果相符[4]。同时在肿瘤的发生过程中，HIF1α表达的上调，促进了肿瘤细胞凋亡的发生。肿瘤细胞的凋亡有p53依赖性和非p53依赖性两条途径,而低氧诱导的凋亡是通过HIF1α为中介的p53依赖性途径起作用。An等[5]研究提示,HIF1α能对野生型p53蛋白降解起抑制作用,从而稳定p53使其水平升高,使肿瘤细胞凋亡。另有研究证实HIF1α表达的上调抑制了低氧所导致的凋亡［6］。本实验对照组中低氧条件下肿瘤细胞的凋亡率明显高于常氧条件，进一步证实了在本实验条件下HIF1α促进肿瘤细胞凋亡的发生起主要作用。

    人参皂甙Rg3是从人参根的浸出液中分离出的一种有效成分，目前的研究表明Rg3具有抑制肿瘤细胞增殖与浸润、抗肿瘤细胞转移、抑制血管内皮细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡及提高机体免疫功能等多种功效 [79]。潘子明等[10]证实人参皂甙Rg3是通过下调肿瘤VEGF mRNA及蛋白质的表达,从而阻滞肿瘤新生血管的形成。本实验研究表明Rg3对降低了VEGF蛋白和mRNA水平的表达，其原因可能为Rg3降低了HIF1α的转录以及蛋白的表达。可以进一步推测，Rg3通过一系列的信号途径抑制了 Hep2细胞中的HIF1α的mRNA及蛋白水平的表达，从而抑制了VEGF的转录活性，降低了VEGF的表达，抑制了肿瘤周围新生血管的生成,从而阻断了肿瘤生长所需要的血供与营养等，这可能是人参皂甙Rg3抗肿瘤作用的机制之一。在本实验中Rg3降低了HIF1α的水平，阻断了对肿瘤细胞凋亡的促进作用，但可能促进了HIF1α抑制低氧所导致的凋亡作用的发生，同时[11]人参皂甙Rg3可以直接作用于癌细胞，通过诱导其凋亡，抑制肿瘤的生长或诱导其分化使其逆转，促进肿瘤组织死亡。Kung等[12]认为细胞周期的阻滞和细胞凋亡诱导是一致的，通过流式细胞仪检测细胞周期时相和凋亡率显示低氧条件下Rg3通过诱导G0/G1期阻滞，促进细胞凋亡。本研究提示HIF1α有可能作为肿瘤缺氧微环境下抗癌药物的作用靶点，阻断该基因的表达，可能对肿瘤的增殖与转移具有相当的阻抑作用，对提高抗癌疗效的研究有一定的启发作用，而人参皂甙Rg3有望成为针对HIF1α这一作用靶点的抗癌新药。

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