下丘脑室旁核组胺H 3 受体对哮喘大鼠呼吸运动的调节

作者:季吉,董榕

     【关键词】  下丘

　　［摘要］目的: 探讨下丘脑室旁核（PVN）组胺H 3 受体对哮喘大鼠呼吸运动的影响及其作用机制。 方法:将大鼠随机分为对照组、模型组、假手术组、生理盐水组、PVN内微量注射特异性组胺H 3 受体激动剂R.（α）.甲基组胺［（R.（α）.methylhistamine，R.（α）.MeHA］的R.（α）.MeHA组以及PVN内微量注射组胺H 3 受体拮抗剂thioperamide（Thio）的Thio组，采用中枢立体定位技术，在PVN植入带芯的不锈钢外套管，通过内管恒速注射不同药物。用电生理方法记录膈肌肌电活动;用胸内压法测定气道阻力、肺顺应性。 结果: 与对照组比较，模型组膈肌放电频率增加，膈肌肌电积分幅值下降，气道阻力增加，肺顺应性降低（均为P<0.01）。与生理盐水组比较，R.（α）.MeHA组膈肌放电频率下降（P<0.01），膈肌肌电积分幅值增加（P<0.05），气道阻力降低（P<0.01），肺顺应性改善（P<0.01）;Thio可阻断上述效应，差异均有统计学意义。 结论: PVN内组胺H 3 受体参与呼吸运动的调节，特异性激动组胺H 3 受体能改善哮喘大鼠的肺功能。

　　［关键词］ 组胺H 3 受体;呼吸;下丘脑室旁核;哮喘;大鼠     　　支气管哮喘（简称哮喘）是一种气道慢性变应性炎症性疾病，临床表现为反复发生喘息、呼吸困难，以可逆性气道阻力增加为基本特征。组胺是哺乳动物体内分布广、作用强的生物活性胺类。在脑内，组胺作为一种重要的中枢神经递质参与调控正常动物的呼吸功能活动［1］ 。本实验小组前期研究发现，哮喘急性发作时，中枢组胺含量明显升高，以下丘脑最为明显，提示下丘脑组胺增多与哮喘发作关系密切［2］ 。组胺H 3 受体是一类对呼吸功能活动具有重要调节作用的受体体系，组胺本身的合成与释放受分布于组胺能神经元胞体和神经末梢的组胺自身H 3 受体的负反馈调控［3］ 。现代研究发现，下丘脑室旁核（hypothalamic paraventricular nuclei，PVN）内分布有大量的组胺能神经元和H 3 受体［4］ 。PVN内组胺是否通过H 3 受体参与调节哮喘时的呼吸功能呢?有关这方面的研究目前未见报道。因此本实验拟通过PVN内微量给药，观察激动或阻断组胺H 3 受体对哮喘大鼠呼吸运动的影响，旨在初步探讨PVN内H 3 受体水平与哮喘发病之间的关系。      　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与器材     　　组胺H 3 受体激动剂R.（α）.甲基组胺［（R.（α）.methylhistamine，R.（α）.MeHA］和组胺H 3 受体拮抗剂thioperamide（Thio）均购自Sigma公司，微量注射器WZ.50购自原浙江医科大学医学仪器厂，呼吸流量换能器、MacLab.4s AD Instruments和Chart v3.6.4软件均购自澳大利亚AD Instruments Pty Ltd公司，Power Macin-tosh6100.66计算机购自美国Apple Computer Inc公司。     　　1.2 动物     　　成年雄性SD大鼠，体重250～300g，购自东南大学实验动物中心，在安静、温暖（18～25℃）、避强光、明暗周期为10.14h的实验室预饲养3d后供实验使用。     　　1.3 方法     　　1.3.1 造模方法和分组  哮喘模型参照文献［5］方法进行，即实验第1天每只大鼠腹腔注射卵蛋白（ovalbu-min，OA）10mg、氢氧化铝100mg、灭活百日咳杆菌疫苗（上海生物制品研究所）5×10 9 共1ml致敏，第3天再次注射上述抗原液1ml以强化。2周后用1%OA生理盐水溶液（2～3ml?min -1 ，颗粒直径≤5μm）雾化吸入，1次?d -1 ，连续3d。大鼠出现烦躁不安、呼吸急促、呼吸困难、喘息、腹肌明显收缩等哮喘症状为造模成功。致敏大鼠随机分为模型组、假手术组、生理盐水组、R.（α）.MeHA组和Thio组。对照组:正常大鼠腹腔注射生理盐水1ml，第3天再注射生理盐水1ml，2周后同法雾化吸入生理盐水。     　　1.3.2 PVN中枢立体定位术和核团微量注射  大鼠在戊巴比妥钠30～40mg?kg -1 腹腔注射麻醉下，固定于脑立体定位仪上，每组半数大鼠定位左侧PVN，另半数定位右侧PVN。按照George Paxinos and Charles Wat-son图谱，植入带芯的外径0.4mm的不锈钢外套管。以前囟为零点定位PVN，坐标为:AP-1.8mm（前囟后），LR0.2mm，H-7.9mm（颅骨下）。    　　R.（α）.MeHA组和Thio组:PVN内分别微量注射R.（α）.MeHA2μg和Thio5μg，给药体积均为1μl，用恒速推进器以1μl?min -1 速度恒速注射，注药后留管20min。假手术组:PVN埋管，但不注射药物。    　　生理盐水组:PVN微量注射1μl生理盐水。     　　1.3.3 实验步骤及数据采集  麻醉同上，大鼠背位固定。行气管插管，连接呼吸流量换能器测定潮气量（tidal volume，V T ）。将食管作横向切口，插入头端有4个侧孔的注水导管，连接压力换能器供测定食管内压（intrapleural pressure，IPP）以代替胸内压（thoracic pres-sure，P th ）。正中切开上腹部皮肤，分离出剑突及膈肌片，将双铂金引导电极插入膈肌片内引导膈肌肌电活动并经前置放大器将信号放大。呼吸流量、食管内压和膈肌肌电3种信号经PowerLab.400生物信号采集系统A.D转换后接入Power Macintosh6100.66计算机。待呼吸稳定后先连续记录30min，注药后再连续记录30min。    　　实验结束后用相同给药法在原点注射等体积美蓝，主动脉灌注后取脑制备冰冻切片（片厚40μm），查找注射点，对照大鼠脑立体定位图谱确定注射部位是否准确。定位不准者，数据不纳入统计。     　　1.3.4 实验结果分析  将采集到的膈肌肌电活动信号、流率（V）、V T 、和P th 用Chart v3.6.4软件自动计算，得到以下指标:（1）膈肌肌电活动，包括膈肌放电频率（frequency of diaphragmatic electric activity）和膈肌放电积分幅值（integrated diaphragmatic electric activity，IDEA，相当于V T ［6］）;（2）呼吸功能，包括呼气时程.吸 气时程（expiration time.inspiration time，T E .T I ）、气道阻力（airway resistance，R AW ）、肺顺应性（lung compliance，C L ）。

　1.4 统计学处理     　　数据均以ˉx±s表示，两组间比较用student's t检验，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果     　　2.1 哮喘大鼠PVN微量注射R.（α）.MeHA或Thio对膈肌肌电的影响     　　与对照组比较，模型组大鼠OA激发哮喘发作后，膈肌放电频率增强（P<0.01），IDEA减小（P<0.01）。假手术组和生理盐水组膈肌肌电活动与模型组比较，差异无统计学意义。R.（α）.MeHA组与生理盐水组比较，膈肌放电频率显著下降（P<0.01），IDEA增大（P<0.05）。Thio组则上述效应被阻断，与R.（α）.Me-HA组比较，差异有显著性。见表1。     　　表1  PVN微量注射R.（α）.MeHA或Thio对哮喘大鼠膈肌肌电的影响（略）    　　Tab1 Effects of microinjection R.（α）.MeHA or Thio into PVN on diaphragmatic electric activity in rats with asthma    　　与对照组比较，1）P<0.01;与生理盐水组比较，2）P<0.01，3）P<0.05;与R.（α）.MeHA组比较，4）P<0.01     　　2.2 哮喘大鼠PVN微量注射R.（α）.MeHA或Thio对肺功能的影响     　　与对照组比较，模型组大鼠OA激发哮喘发作后，T E .T I 及气道阻力明显增加，肺顺应性显著下降（均为P<0.01）。假手术组和生理盐水组肺功能情况与模型组比较，差异无统计学意义。R.（α）.MeHA组与生理盐水组比较，T E .T I 及气道阻力显著下降，肺顺应性增加（均为P<0.01）。Thio组则上述效应被阻断，与R.（α）.MeHA组比较，差异有显著意义。见表2。     　　表2  PVN微量注射R.（α）.MeHA或Thio对哮喘大鼠肺功能的影响（略）    　　Tab2 Effect of microinjection R.（α）.MeHA or Thio into PVN on pulmonary function in rats with asthma    　　与对照组比较，1）P<0.01;与生理盐水组比较，2）P<0.01，3）P<0.05;与R.（α）.MeHA组比较，4）P<0.01    　　注:1cmH 2 O=0.098kPa     　　3 讨论     　　组胺H 3 受体是1983年发现的一种组胺受体新亚型，在脑内分布极为广泛，几乎存在于所有的脑区。它不仅作为组胺能神经的突触前自身受体，负反馈调节组胺的合成、释放和代谢，而且也以异身受体的方式存在于其它神经元的末梢，如胆碱（Ach）能神经、5.羟色胺（5-HT）能和去甲肾上腺（NE）能神经末梢上，负反馈调节脑内Ach、5.HT和NE的释放［1］ 。中枢组胺能神经系统通过这一机制参与调节中枢神经系统的功能，而中枢神经系统功能的变化对哮喘大鼠呼吸功能有着显著的影响［7］ ，提示中枢组胺能神经系统可能与哮喘的发病关系密切。本实验在中枢给予H 3 受体激动剂或拮抗剂从正反两方面观察H 3 受体对哮喘大鼠呼吸功能的调节作用。    　　PVN是下丘脑前区最显著的核团之一，参与呼吸活动的调节。形态学研究表明，PVN内有大量的组胺能神经元，可直接投射到背侧呼吸组的孤束核［1］ 。而孤束腹外侧核是基本呼吸中枢之一。呼吸浅快、V T 下降、呼气时间相对延长是哮喘急性发作的典型特征，在膈肌肌电图上表现为放电频率增加、积分幅值下降及T E .T I 值增高。本实验观察到在PVN内微量注射R.（α）.MeHA后，哮喘大鼠膈肌放电频率减少（P<0.01），积分幅值增加（P<0.05），T E .T I 降低，此作用可被Thio特异性地阻断。这说明组胺H 3 受体参与哮喘状态下呼吸活动的中枢调控，相对延长吸气时间，增加V T ，呼吸呈深慢型。本实验小组前期研究发现，侧脑室给予Thio能够明显降低哮喘豚鼠下丘脑组胺的含量［2］ ，推测组胺H 3 受体参与调节呼吸运动的中枢机制可能与其负反馈地抑制PVN内组胺的合成和释放，调节PVN内组胺能神经元活性，从而影响支配孤束核内的呼吸相关神经元，产生吸气易化作用，进而改变呼吸节律有关。    　　气道阻力主要是指气体通过呼吸道遇到的摩擦阻力，它以单位时间流量所需的压差来表示，即cmH 2 O?ml -1 ?s -1 。气道阻力与气体的黏度及管道的长度成正比，而和管腔半径的四次方成反比。所以在哮喘发作支气管收缩时，气道阻力大大增加。本实验证明，在哮喘发作时，大鼠气道阻力明显高于对照组（P<0.01）。R.（α）.MeHA组低于生理盐水组（P<0.01），说明PVN内给予R.（α）.MeHA可以降低哮喘大鼠气道阻力。肺的顺应性又称肺的应变性，是测定肺的弹力是否正常的一种方法，以单位胸腔压力下肺容量的改变来表示，即ml?cmH 2 O -1 。在哮喘发作时，大鼠肺顺应性明显降低，此结果与以往的报道［8］ 一致。给予R.（α）.MeHA可以提高哮喘大鼠肺顺应性，而H 3 受体特异性拮抗剂Thio则能拮抗R.（α）.MeHA的上述作用，提示PVN内H 3受体参与调节哮喘大鼠的肺功能。前期研究发现，侧脑室途径激动中枢组胺H 3 受体后，哮喘豚鼠呼吸道内神经源性炎症介质P物质（substance P，SP）减少，而肺内SP增多是哮喘发病的重要环节［9］ ，推测PVN内H 3受体可能也通过某种神经通路参与调控哮喘气道局部神经源性炎症，从而缓解气道阻塞症状。    　　本实验小组曾多次在同一动物PVN内注射R.（α）.MeHA，结果能够改善由哮喘引起的呼吸功能活动的改变，而静脉内注射相同剂量的R.（α）.MeHA则无反应，说明PVN内注射R.（α）.MeHA引起的呼吸效应的确是其中枢性作用。此外在实验中，所用的R.（α）.MeHA pH、体积及温度等均与对照组用的生理盐水相同，排除了理化因素对呼吸活动的影响。同时特设了假手术组和生理盐水组，以避免手术、给药等应激对实验结果的干扰。    　　综上所述，PVN内组胺H 3 受体参与调节哮喘大鼠的呼吸功能，这一结果提示中枢组胺能神经系统与哮喘发病关系密切，但具体机制还有待进一步的研究。

　　［参考文献］      　　［1］BROWN R E，STEVENS D R，HAAS H L.The physiology of brain histamine［J］.Prog Neurobiol，2001，63（6）:637.672.

　［2］董榕，张敏，时斌，等.哮喘豚鼠脑内组胺含量的变化及中枢组胺H 3 受体的调节作用［J］.现代医学，2003，6（3）:154.156.

　　［3］ARRANG J M，GARBARG M，SCHWARTZ J C.Auto.inhibition of brain histamine release mediated by a novel class（H 3 ）of hista-mine receptor［J］.Nature，1983，302（5911）:832.837.    　　［4］KUROSE Y，TERASHIMA Y.Histamine regulates food intake through modulating noradrenaline release in the para.ventricular nu-cleus［J］.Brain Res，1999，828（1.2）:115.118.    　　［5］ELWOOD W，LOTVALL J O，BARNES P J，et al.Characteriza-tion of allergen.induced bronchial hyperresponsiveness and airway inflammation in actively sensitized brown.Norway rats［J］.J Allergy Clin Immunol，1991，88（6）:951.960.    　　［6］吴中海，徐小元，张枫桐，等.面神经后核内侧区微量注射不同氨基酸类递质对膈肌电活动的影响［J］.第一军医大学学报，1998，18（3）:183.187.    　　［7］楚东岭，宋俊峰，饶志仁，等.中枢神经功能变化对哮喘豚鼠行为学改变及呼吸阻力的影响［J］.中国临床康复，2003，7（12）:1760.1761.    　　［8］LAVOIE J P，MAGHNI K，TAHA R，et al.Conjugates of ovalbu-min and monomethoxypolyethylene glycol abolish late allergic re-sponses and decrease IL.4and IL.5mRNA expression in the rat［J］.Pulm Pharmacol Ther，2003，16（6）:361.369.    　　［9］董榕，张敏.侧脑室注射R.α.四基组胺对哮喘豚鼠呼吸道P物质样免疫反应物的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2003，12（2）:166.170.

　　［基金项目］ 铁道部科技基金资助项目（J98Z009）。

　　（东南大学基础医学院生理学与药理学系，江苏南京 210009）