化疗药物对头颈癌敏感性的研究

     作者：刘　流,　赵德萍,　谢　春,　陆　信,　李　坚,　漆雪梅,　陈锡玲  作者单位:昆明医学院附一院口腔颌面外科(650032);赵德萍,陆信(云南省肿瘤研究所)。　　摘　要:目的　在化疗前进行肿瘤药敏试验,以提高疗效。方法　用M TT法对32例头颈癌患者术后的肿瘤标本进行体外细胞培养,用8种抗癌药进行敏感性试验,选用2～3种敏感药物应用于同一患者进行化疗。结果　例患者治疗有效,未出现明显的毒副作用,均存活3年以上。结论　在化疗前进行药敏试验,选择高效药物用于同一患者,对于提高恶性肿瘤的疗效及增加生存率,减少毒副作用的产生具有较重要的意义和实际应用价值。　　关键词:头颈癌;药敏试验;化疗　　中图分类号:R739.8　　　文献标识码:A　　　文章编号:100524979(2001)0320204204CHEMO SENSI T IVI TY TEST&IND IV IDU AL CHEMOT HERAPYFOR  HEAD AND NECK CANCERSL IU L iu,ZH A O D e2p ing,X IE Ch un,et al (D ep ar mt ent  of O ral &M ax illof acial  S uge ry.T he F irst A ff  ilia ted H osp ital  ofK unm ing M ed ica l Co llege  K unm ing,650032)　　Abstract:Objectvie　To enhance chemotherapeutci effeincy of head and neck cancer,the chemosensitviitywa s  tested befor e chemo t herapy .M ethods　Th e chemo s ens itviiteis of 32 fresh spe cime ns  of huma n head and neckcancers we re tested w ith M TT  a ssay to eight  an tciancer dur gs :52fluo rour acili(52Fu),vnicristine(VC R),M etho troxa tumM( TX),B leomy cni(BLM),Ci spl a tmi(DD P),Ad  raimc in(ADM),Pi ngyanm ycni(PYM)andCycolp hos ph am dium(CTX)Ind ivdiual  chemo  thezap y wa s  us ed for  the pa t eint s w ith selectnig 2～3 sens itviitydr ugs .Results　Th e chemo t herape ut ic effciacy of 32 pa t ient sw  as  sat isfynig.Th e tox icithes and sdie effectsw e rem ild.3 year  sur vail  rat es we re 100%.Conclusoins 　Chemo  sens itivity test and nidi vdiual  chem ot herapy  ar e val u2abl e and signi ficant .　　Key words:Head and neck cancer;Drug sensitviity test;Chemotherapy　　化疗在头颈癌的综合治疗中是不可缺少的重要组成部分,有不可低估的应用前景[1～4]。目前治疗恶性肿瘤的化疗药物较多,但对头颈癌的疗效仍不理想,这与药物抗癌作用的选择性差;肿瘤存在着个体差异性以及多重抗药性等因素有关[5,6]。本研究对32例头颈癌患者手术切除的肿瘤组织进行体外细胞培养,并用8种抗癌药进行药敏试验。选择敏感药物用于同一患者体内进行针对性较强的个体化治疗,取得了较好的效果。1　材料和方法1.1　8种化疗药物52氟尿嘧啶(52Fu),长春新碱(VC R),氨甲蝶呤(M TX),博莱霉素(BLM),顺氯氨铂(DDP),阿霉素(ADM),平阳霉素(PYM),环磷酰胺(CTX)均为临床用注射针剂。配制成实验用浓度,放入-20°C保存备用。1.2　试剂及仪器M TT (四甲基偶氮唑盐)由华美生物公司提供,DM SO(二甲基亚砜)由北京市化工试剂厂生产(分析纯),酶联免疫检测仪570波长2华东电子管厂产品,W Z21微型血液振荡器2北京朝阳电子仪器二厂产品,WM ZK210型CO2,Incubator2重庆试验设备厂产品。1.3　舌癌细胞株(TCa28113)从上海药物研究所引进TCa28113舌癌细胞株。1.4　肿瘤标本1.4.1　标本来源　32例均为本科手术切下的实体瘤,其中舌鳞癌4例,上颌窦鳞癌1例,颊粘膜癌1例,腮腺癌7例(鳞状细胞癌2例,腺泡细胞癌2例,恶性混合瘤1例,粘液表皮样癌1例,腺样囊性癌1例),颌下腺癌4例(鳞状细胞癌1例,腺癌2例,恶性混合瘤1例),舌下腺癌4例(腺癌1例,粘液表皮样癌2例,腺样囊性癌1例),口咽癌2例,唇癌2例,腭部粘表2例,腭鳞癌1例,面部基底细胞癌2例和恶性淋巴瘤2例。所有病例均有病理切片证实。1.4.2　标本的处理　在严格无菌的条件下将外科手术切下的肿块放入生理盐水内并及时送到细胞培养室,挑取无坏死溃烂的新鲜癌组织,放入双抗及庆大霉素的无血清RPM I21640液清洗,(青霉素钠200Λg m l,硫酸链霉素200Λg m l,硫酸庆大霉素100Λg m l)然后剪成碎片3～5mm 3,用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化组织,将被消化的组织液移入25m l玻璃培养瓶内,在镜下观察组织解聚和细胞离散情况,当见癌组织疏松,癌细胞游出时,加入含血清1640液终止消化,再将被消化的组织液吸入10m l小瓶内沉淀,取上层混悬液离心(1000r m in)、清洗、制备成单细胞悬液,调整细胞浓度后培养于含15%小牛血清RPM I 1640营养液中,培养3～5天,为测试抗癌药物敏感试验做准备。1.5　体外肿瘤细胞的药敏实验收取培养已存活及增殖的自体瘤细胞用苔粉兰染色,计数活细胞在90%以上,细胞浓度(1～5)×105个m l,接种于96孔平底细胞培养板中,加瘤细胞液90Λl孔,放置于CO2孵育箱4h(或见贴壁后),加入待测药物(8种抗癌药),其浓度为临床常规用药量折算稀释成实验量,这一浓度为体外实验的标准浓度,同时设高、中、低三个浓度,10Λl孔,每个浓度3个平行孔,对照组5个平行孔。每次设空白及阳性药组。经药物作用48～72h后加入M TT(5mgm l)20Λl孔,温育4h,吸除孔内液体,加入DM SO100Λl孔,用W 221微型血清振荡器振荡5～10m in,再用DG3022A酶联免疫检测仪(波长570nm,华东电子管厂产品):测出每也孔光密度OD值。细胞抑制率则按下列公式计算:细胞抑制率%=对照孔测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值对照孔测定的平均OD值×100%1.6　临床病例应用根据体外肿瘤细胞药敏实验结果,选择敏感的化疗药物用于同一个体病人进行化疗,均选用2～3种敏感的药物进行联合化疗。2　结果　　肿瘤组织病理类型对8种抗癌药的敏感性见表1。肿瘤的生长部位对8种化疗药物的敏感性见表2。头颈癌对单一化疗药物的敏感性见表3。　　临床应用:对32例患者化疗效果未出现明显的副作用,均存活3年以上,术后常规检查及复查未见复发或转移。表1　肿瘤组织病理类型对8种化疗药物的敏感性病理类型例数(n)体外药物敏感例数52Fu V CR M TX BLM DD P ADM PYM CTX鳞癌14 13 2 14 14 12 0 14 0腺癌3 3 0 1 1 3 3 0 0粘液表皮样癌5 3 0 1 2 3 2 2 0腺性囊性癌2 2 1 1 2 2 2 1 0恶性混合瘤2 2 1 1 2 2 2 1 0腺泡细胞癌2 2 0 1 1 2 2 1 0基底细胞癌2 2 1 1 2 2 0 1 0恶性淋巴瘤2 0 2 0 2 0 2 1 1合计32 27 7 20 26 26 13 21 1　　注:IR≥30%　口腔颌面外科杂志　2001年第11卷第3期　•205•表2　原发灶对8种化疗药物的敏感性原发灶例数(n)体外药物敏感例数52Fu V CR M TX BLM DD P ADM PYM CTX口腔癌8 7 0 6 6 6 2 6 0唇癌2 2 0 2 2 1 0 2 0上颌窦癌1 1 0 1 1 1 0 1 0口咽癌2 2 2 2 2 2 0 2 0面部皮肤癌2 2 1 1 2 2 0 1 0颈部恶性淋巴癌2 0 2 0 2 0 2 1 1涎腺肿瘤15 13 2 8 11 14 9 8 0合计32 27 7 20 26 26 13 21 1　　注:IR≥30%表3　头颈癌对单药的敏感率(IR≥30%)例数(n)敏感例数耐药例数敏感率(%)52FU 32 27 5 84.4V CR 32 7 25 21.9M TX 32 20 12 62.5BLM 32 26 6 81.3DD P 32 26 6 81.3ADM 32 13 19 40.6PYM 32 21 11 65.6CTX 32 1 31 3.13　讨论3.1　化疗药物敏感性在头颈癌治疗中的意义由于肿瘤细胞生物学的异质性特点,使得肿瘤临床化疗变得较为复杂,化疗对不同类型的肿瘤,其效果往往有较大的差异,在使用化疗药物之前,对其进行敏感性检测,筛选出敏感药物,用于同一患者进行针对性较强的个体化治疗,以减少用药的盲目性,从而提高疗效,增加生存率或改善生存质量[7～9]。本组32例采用术后切除的肿瘤进行体外原代细胞短期培养,并用8种抗癌药物进行药物敏感性测定,在药敏指导下化疗,随访3年,全部存活,经术后常规复查,未发现复发或转移迹象。12例患者经过两个疗程的化疗,无明显的毒副作用发生。因此我们认为,在化疗前进行肿瘤细胞的体外培养及抗癌药物敏感试验,选择敏感药物对同一患者进行个体化治疗,在头颈癌的治疗中具有较重要的意义。3.2　头颈癌对8种常用化疗药物的敏感性本实验选用8种抗癌药,均为临床上常用于治疗头颈癌的化疗药物。从表1可以看出,以组织病理类型分类,鳞癌的敏感药物有M TX、BLM、PYM、52Fu和DD P;腺癌的敏感药物有:52Fu、DD P和ADM;粘液表皮样癌的敏感药物有52FU、DD P、ADM、BLM和PYM;腺样囊性癌和恶性混合瘤的敏感药物有:52Fu、BLM、DDP和ADM;腺泡细胞癌的敏感药物有:52Fu、DDP和ADM;基底细胞癌的敏感药物有52Fu、BLM、DDP;恶性淋巴瘤的敏感药物有:VCR、BLM、ADM。从表2可以看出,以原发病灶分类,口腔癌的敏感药有:52FU、M TX、BLM、DD P和PYM;唇癌和上颌窦癌的敏感药有:M TX、BLM、DD P、PYM;口咽癌的敏感药物有:52Fu、DD P、BLM、M TX和PYM。从表3可以看出,头颈癌对单一化疗药物的敏感率为52FU 84.4%,V CR 21.9%M TX 65.5%,BLM 81.3%,DD P81.3%,ADM 40.6%,PYM 65.6%,CTX 3.1%。可见,头颈癌对52Fu、BLM、DDP、PYM和M TX较敏感。头颈癌对CTX不敏感。可能是因为CTX需要在肝脏线粒体酶类的作用下,转化成中间产物(42羟环鳞酰胺与醛磷酰胺)才能发挥杀伤作用,而对体外培养的肿瘤细胞无作用之故。总之,在化疗之前,先进行药物敏感实验。3.3　M T T法用于化疗药物敏感试验肿瘤细胞对化疗药存在着天然的抗药性及获得性抗药。因此肿瘤患者对各种化疗药物的敏感性差异很大,在化疗过程中,由于不能准确地选用有效药物,常可导致临床治疗无效及加速了耐药性的产生,因此,准确快速的肿瘤化疗药敏检测对指导临床选药,提高疗效具有重要意义。目前药敏试验法有核酸前体掺入法、集落形成法(HTCA)、区别染色细胞毒法(D ISC)、四氮唑盐法(M TT)和荧光测定微培养细胞毒试验(FM CA)等。本实验用M TT法,其原理是活细胞特别是增殖期细胞,脱氢酶通过线粒体能量代谢,将M TT还原成可显色的甲　(formazan),甲　的形成量也细胞活力成正比,因此药物对肿瘤细胞活力的影响(即杀伤程度),可量色定量。我们采用M TT法对32例头颈癌体外培养的肿瘤细胞进行敏感试验,其结果与临床应用药物的有效性相一致,说明该方法的准确性,此外M TT法还有快速、简便、经济,不需放射性同位素,结果重复性好等优点。参考文献:[1]　B lon s H,Cabelguenne A,Ca rno t R,et a l.M i2cro sa tellite ana lysis and respon se to chem therap y inhead and neck squam ou s cell ca rcinom a s[J].In t JCancer,1999,84(4):410.[2]　J aa skela2Saa ri HA,Ka irem n KJ,R am say HA,et a .lL abelling of b leom ycin w ith anger2rm itter increa sescyto tox icity in squam ou s cell cancer cell lines[J].In tJ R ad ia t R io l,1998,73(5):565.[3]　Sack s PG,H a rris D,Chon TC.M odu la tion ofg row th and p ro lifera tion in squam ou s cell ca rcinom aby retino ic acid:a ra tiona le fo r am b ina tion therap yw ith chem o therap en tic agen ts[J].In t J Cancer,1995,61(3):409.[4]　B raakhu is HJ.V an Dongen GA,B agnay M,et a .lP reclin ica l chem o therap y on hum an head and neckcancer xenog rafts g row n in a thym ic nude m ice[J].H ead N eck,1989,11(6):511.[5]　N oda L,Fu jieda S,Sdk i M,et a .lInh ib iton of N 2L inked g luco syla tion by tun ica rnycin enhances sen si2tivity to cisp la tin in hum an head and neck ca rcionm acells[J].In t J Cancer,1990,80(2):279.[6]　W elters M J,R ich tinger2Schepm an AM,B aan RA,et a .lPha rm acodyna rm ics of cisp la tin in hum an headand neck cancer;co rrela tion betw een p la tinum con2ten t,DNA adduct levels and d rug sen sitivity in vitroand in vitro[J].B r J Cancer,1999,79(1):82.[7]　韩晓凤.M T T法体外药敏试验研究进展.肿瘤,1999,19(1):55.[8]　Sch royon s W,T uen i K,Dod ion P,et a l.V a lida tionof clin ica l p red ictive va lue of in vitro co lo rim etricchem o sen sitivity a ssay in head neck cancer[J].B r JCancer,1990,26(7):834.[9]　吴舟锋.肿瘤化疗药物敏感性试验[J].国外医学:外科学分册,1998,23(3):153.