神经生长因子和神经节苷脂对新生鼠缺氧缺血性脑损伤海马神经细胞的保护作用
发表时间：2009-08-27 浏览次数：690次
神经生长因子和神经节苷脂对新生鼠缺氧缺血性脑损伤海马神经细胞的保护作用胡伟1,赵聪敏2,巩守平3 (1武警陕西总队医院儿科,西安710054;2第三军医大学新桥医院儿科,重庆400037;3西安交通大学第二医院神经内科,西安710004) 提要:目的 观察联用神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和神经节甘脂(gangliosideGM1)对实验大鼠缺氧缺血性脑损伤的治疗作用,探讨其神经保护的可能机制。方法 120只新生鼠分为假手术组、缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-is-chemic brain injury, HIBI)组、NGF治疗组、GM1治疗组和NGF+GM1治疗组。给药后以HE染色观察各组海马区神经细胞形态变化,免疫组化观察Bcl-2、Bax蛋白表达, TUNEL法观察海马区神经细胞凋亡情况。结果 缺氧缺血后HIBI组海马区病理变化明显,药物干预组上述变化减轻,合用组为著;假手术组海马区Bcl-2表达较弱,HI(缺氧缺血)后该区Bcl-2表达仍弱,Bax表达增强,出现凋亡细胞;药物干预组Bcl-2表达较HIBI组增强, Bax表达较HIBI组减弱(P<0·01)凋亡细胞减少,合用组最明显。结论 HIBI后Bax蛋白表达增强,细胞凋亡增加。两药联用可上调Bcl-2表达,下调Bax表达,使凋亡细胞减少,这可能是其治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤的机制之一。 关键词:缺氧缺血性脑损伤;神经生长因子;神经节阿苷脂;凋亡 中图法分类号:R322. 81;R743. 31;R977文献标识码:AProtective effect of combined NGF and ganglioside GM1on hypoxic-ischem ic braininjury of newborn rats UWei1,ZHAO Cong-min2,GONG Shou-ping3(1Department of Pediatrics,GeneralHospital of ShaanxiArmed Police,Xi’an710054;2Department of Pediatrics,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400037;3Department ofNeurology,The SecondHospital ofXi’an JiaotongUniversity,Xi’an 710004,China) Abstract:Objective To study the therapeutic effect of combined administration of nerve growth factor (NGF)and gangliosideGM1on the hypoxic-ischemic brain injury(HIBI)ratmodel and the relevant involving mechanisms.Methods A total of 120 7-day old ratswere randomly divided into 5 groups:sham-operation group,HIBI group,NGF group,GM1group and NGF+GM1group. HE staining,immunohistochemical stai-ning andTUNEL stainingwere employed respectively to study themorphologicalchanges,bcl-2 and Bax expres-sions and apoptosis in the hippocampalneuron after treatmen.tResults Pathological changeswere observed in the hippocampalneuron afterHIBI. In NGF+GM1group,the level ofBcl-2 expression was increased signifi-cantly(P<0. 01),while that ofBax and the number of apoptotic cells in the hippocampal region were de-creased significantly in comparison to theHIBI group(P<0. 01).Conclusion The combined administrationofNGF andGM1may increase Bcl-2 expression and attenuate Bax expression,and thus inhibit the apoptosis inhippocampal region. Key words:hypoxic-ischemic brain injury;nerve growth factor;gangliosideGM1;apoptosis 缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)是由于宫内窘迫、新生儿窒息等引起的新生儿脑部严重损伤,有较高的发病率和病死率,也是导致智能落后和脑性瘫痪等儿童伤残的主要原因[1]。HIBI发病机制复杂,涉及多个环节,而凋亡是后期神经细胞缺失和功能障碍的重要原因。细胞凋亡持续时间较长[2],给予适当治疗可逆转凋亡的病理过程,从而改善预后。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是一种神经营养性因子,而神经节苷脂(gangliosideGM1)是内源性神经营养因子的前体增强剂。从理论角度分析,二者对HIBI后神经系统功能恢复具有协同作用。因此有必要进一步研究联合应用NGF和GM1神经生长因子和神经节苷脂对新生鼠缺氧缺血性脑损伤海马神经细胞的保护作用对HIBI后神经细胞的保护作用。我们采用新生大鼠HIBI模型,观察NGF、GM1及NGF与GM1联合应用对HIBI后海马神经细胞形态学、凋亡及其调控基因Bcl-2、Bax蛋白表达的变化,了解药物治疗对海马神经细胞的保护作用,初步探讨联合应用NGF与GM1对HIBI的保护作用及其可能机制。1 材料与方法1. 1 仪器 自制透明有机玻璃缺氧舱,氮氧混合气体(8%氧, 92%氮),光学显微镜,Q550CW型图像采集与分析系统。1. 2 试剂 注射用鼠神经生长因子(NGF,商品名恩经复)(厦门北大之路生物工程公司);注射用神经节苷脂(GM1,商品名施捷因)(广州精优惠南医药公司);兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体,小鼠Bax单克隆抗体,免疫组化染色S-P试剂盒,细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士得生物工程公司)。1. 3 实验动物分组及处理 出生7 d的健康SD大鼠120只,体质量12~16 g,雌雄不拘(第四军医大学实验动物中心)。按照实验设计分为假手术组、缺氧缺血性脑损伤(HIBI)组、NGF治疗组、GM1治疗组和NGF+GM1治疗组,每组24只。各组均分为HIBI后6、24、72 h及7 d时间组,每组鼠6只。 参照Rice法制作HIBI模型[3]。大鼠乙醚吸入麻醉,常规消毒,取颈部正中切口,暴露并双线结扎左侧颈总动脉,缝合皮肤。恒温(36. 5℃)水浴箱恢复0. 5~1 h,再置于有机玻璃缺氧舱中(温度36~37℃),以3 L/min的速度持续输入氧浓度为8%的氮氧混合气体2 h,制成HIBI模型。缺氧后新生鼠放回母鼠身边常规喂养。假手术组只切开大鼠颈部皮肤并暴露左颈总动脉,不结扎,缝合皮肤后不入缺氧舱,常规喂养。NGF组、GM1组及合用组以腹腔注射法分别给药,每日1次,连用7 d。NGF组予浓度为200 U/ml的NGF 10 ml/kg+生理盐水0ml/kg;GM1组予浓度为2 mg/ml的GM110 ml/kg+生理盐水10 ml/kg;NGF+GM1组予浓度为200 U/ml的NGF 10 ml/kg+浓度为2 mg/ml的GM110 ml/kg;HIBI组只注射等量的生理盐水。各组均于缺氧缺血(HI)后6、24、72 h、7 d灌注,取脑,以4%多聚甲醛溶液固定,于视交叉、四叠体平面冠状平行切除额部及小脑、脑干组织,取材修饰后行脑组织脱水,石蜡包埋,冠状切片(片厚4μm),备检。1. 4 组织病理学观察 石蜡切片HE染色,普通光学显微镜观察各组海马组织形态变化。1. 5 Bcl-2和Bax蛋白免疫组化染色 每个动物标本取4张相邻的脑组织切片(2张行苏木精复染备组织学观察, 2张不行苏木精复染以备测灰度值),行S-P免疫组化染色。光学显微镜下观察,细胞质内反应物质呈棕黄色颗粒为免疫组织化学染色阳性细胞。结果用Q550CW型图像信号采集与分析系统进行处理,每张切片在海马区随机取6个位置相应、不重复的视野(CA1区3个视野, CA3区3个视野),应用Qwin软件测量灰度值,取6个视野均值作为该片灰度值,每样本2张切片均值作为该样本实验结果,再以该组6例样本的均值作为该组实验结果。1. 6 原位细胞凋亡染色 每个动物标本取2张相邻的脑组织石蜡切片按TUNEL法检测海马区细胞凋亡情况,细胞核染成棕黄色为TUNEL染色阳性细胞。由病理科2位医师分别计数海马区TUNEL阳性细胞,每张切片在400倍光镜下于海马区随机选取6个视野,取2张切片的均值,再以2位医师计数的均值作为该样本实验结果,以该组6例样本的均值作为该组实验结果。1. 7 统计学处理 计量数据以-x±s表示,采用SPSS 11. 0统计软件进行单因素方差分析,两两比较用Turkey方法。2 结果2. 1 HE染色海马区形态学变化 HE染色光镜下可见假手术组双侧及HIBI组右侧大脑海马结构层次清楚,细胞排列整齐、形态正常。HIBI组左脑海马区于HI后6 h出现细胞肿胀、排列紊乱, 24 h出现细胞变性、坏死; 72 h时变性、坏死更趋明显,HI后7 d海马区细胞呈现片状坏死软化。NGF组、GM1组及NGF+GM1组在各时间点左侧海马病理改变较HIBI组减轻,尤以合用组为著。2. 2 各组海马区凋亡细胞的变化 光镜下细胞核呈棕黄色表现者为TUNEL染色阳性细胞,即凋亡细胞。假手术组海马区偶见凋亡细胞;HIBI组于6 h出现凋亡细胞,持续至7 d;NGF组和GM1组各时间点凋亡细胞数较HIBI组减少(P<0·01); NGF+GM1组凋亡细胞数较NGF组、GM1组减少(P<0·01,P<0·05)(表1)。表1 各组大鼠左侧海马区细胞凋亡数目的变化(个/视野,n=24,-x±s)损伤后不同时间组别 6 h 24 h 72 h 7 d假手术组2.89±1.34 2.93±1.17 2.97±1.10 2.81±1.05 HIBI组22.98±4.09a45.46±8.33a56.99±9.78a28.28±5.96aNGF组17.14±4.25ab34.74±5.03ab47.04±6.34ab20.59±4.40abGM1组15.85±4.04ab30.58±6.03ab45.06±6.03cb20.12±4.31abNGF+GM1组10.29±3.51abcd22.05±5.65abcd33.26±5.59abcd14.22±4.19abcea:P<0·01,与假手术组比较;b:P<0·01,与HIBI组比较;c:P<0·01,与NGF组比较;e:P<0·05,d:P<0·01,与GM1组比较2. 3 各组海马区Bcl-2、Bax蛋白表达的变化 光镜下Bcl-2、Bax蛋白表达以细胞质呈棕黄色为阳性细胞。蛋白表达越强,其灰度值越低。HIBI组Bcl-2蛋白表达于HI后6 h出现,持续至7 d。各时间点NGF组与GM1组Bcl-2蛋白表达均较HIBI组增强(P<0·01,P<0·05)(图1A),NGF+GM1组治疗后Bcl-2蛋白表达较NGF组、GM1组明显增强(P2431 <0·01,P<0·05)(图1B)。HIBI组Bax蛋白表达在HI后6 h出现,持续至7 d(图2A)。NGF和GM1治疗组Bax蛋白表达于各时间点均弱于HIBI组(P<0·01),NGF+GM1组治疗后Bax蛋白表达较NGF组、GM1组减弱(P<0·01,P<0·05)(图2B)。假手术组Bcl-2蛋白表达于各时间点呈弱阳性, Bax蛋白于各时间点呈阴性(表2、3)。A:NGF组;B:NGF+GM1组图1 HI后24 h海马CA3区Bcl-2的表达 (S-P×400)A:HIBI组;B:NGF+GM1组图2 HI后72 h海马CA1区Bax的表达 (S-P×400)表2 各组大鼠左侧海马区Bcl-2表达的灰度值变化(n=24,-x±s)损伤后不同时间组别 6 h 24 h 72 h 7 d假手术组158.27±5.13 157.23±4.45 157.67±6.41 158.80±6.02 HIBI组147.18±6.99b141.25±5.65b146.33±7.07b150.75±7.89aNGF组138.42±7.97bc125.71±7.27bd133.58±7.55bd137.98±7.53bdGM1组136.45±7.62bd124.48±6.73bd131.72±7.11bd138.20±6.49bdNGF+GM1组129.25±3.27bd111.90±7.44bdfh116.38±7.95bdfh129.65±5.56bdega:P<0·05,b:P<0·01,与假手术组比较;c:P<0·05,d:P<0·01,与HIBI组比较;e:P<0. 05,f:P<0·01,与NGF组比较;g:P<0·05,h:P<0·01,与GM1组比较表3 各组大鼠左侧海马区Bax表达的灰度值变化(n=24,-x±s)损伤后不同时间组别 6 h 24 h 72 h 7 d假手术组167.94±4.31 165.64±3.61 164.08±3.56 166.16±4.37 HIBI组131.61±8.21b132.63±6.50b125.83±7.99b140.14±9.65bNGF组147.24±7.63bc142.89±6.67bc136.89±4.62bc151.26±8.27bcGM1组147.63±8.62bc144.66±6.23bc140.01±3.77bcd152.32±8.61bcNGF+GM1组158.77±5.80acef157.20±2.05bcef150.40±2.10bcef162.73±3.74cefa:P<0·05,b:P<0·01,与假手术组比较;c:P<0·01,与HIBI组比较;d:P<0. 05,e:P<0·01,与NGF组比较;f:P<0·01,与GM1组比较3 讨论 神经生长因子(NGF)是神经系统中最重要的生物活性物质之一,具有增强神经递质活性、促进合成代谢,维持神经细胞存活、生长、分化和成熟等生物学效应[4]。神经节苷脂(GM1)是大多数神经元生存所必需的,它具有介导细胞与细胞,细胞与微生物以及细胞与基质间的相互作用,可以调控细胞膜中蛋白质的功能[5]。研究表明,NGF和GM1对缺氧缺血后神经细胞凋亡均具有抑制作用。NGF是一种神经营养性因子,而GM1是内源性神经营养因子的前体增强剂。从理论角度分析,二者对HIBI后神经系统功能恢复具有协同作用。 本实验从HIBI新生鼠海马区形态学观察到两药合用治疗后海马区神经细胞损伤减轻,凋亡细胞明显减少,凋亡调控基因Bcl-2、Bax蛋白表达改变,这表明合用NGF和GM1具有较强的神经细胞保护作用,可联合应用NGF和GM1对缺氧缺血性脑损伤进行治疗。此作用国内外鲜有类似报道。根据本实验结果及相关文献分析,联合应用NGF和GM1的脑保护作用机制可能与增强TrkA受体的激活有关。NGF受体分为高亲和力受体TrkA和低亲和力受体P75NTR[6, 7]。TrkA是一种酪氨酸蛋白激酶受体,研究表明TrkA为形成高亲和力结合位点以及介导NGF效应所必需,被认为是NGF的功能受体。TrkA主要在神经系统细胞上表达,NGF与TrkA结合后,通过多种途径促进神经元存活。TrkA不仅能启动促进细胞存活的信号,同时能抑制P75NTR启动的死亡信号[8]。GM1是大多数神经元生存所必需的,它可能与神经营养因子相互作用或激活与神经营养因子相同的信号传导通路有关。实验证实,GM1不仅与NGF有协同作用,能促进NGF诱导的Trk受体的磷酸化,而且单独使用也能活Trk受体,如激活C6神经胶质瘤细胞膜上TrkA受体,激活小脑颗粒细胞膜上的TrkB受体,来防止兴奋性氨基酸毒性作用引起的细胞凋亡[6]。另外,GM1也是Trk受体正常表达和发挥功能所必需的,因为在GM1缺失的NG细胞膜上无Trk受体,且NGF不能诱导其磷酸化[9];GM1和Trk受体都位于细胞膜的GEM区,降低内源性的GM1含量,使磷酸化的TrkB含量也随之降低。NGF还可减轻大鼠皮层损伤引起的神经生化、形态学改变,改善行为障碍,如同时应用GM1可增强NGF的作用。GM1的上述作用可能是通过增强NGF的高亲和力受体TrkA受体二聚作用以及其自身磷酸化,即激活受体酪氨酸激酶而实现。此外, GM1还能直接、紧密结合受体,其效应较NGF单独引发的Trk自身磷酸化增加了3倍,受体激活可促发下游的信号通路而发挥增强NGF的作用。 本实验证实NGF与GM1合用治疗新生鼠HIBI较两药单用效果更好。其机制可能为NGF、GM1合用明显增加了TrkA的自身磷酸化,促进了Bcl-2的表达,抑制了Bax的表达,从而抑制了HIBI后的神经元凋亡。参考文献:[1] MERCURIE, RICCID, COWAN FM,etal. Head growth in infants with hypoxic-ischemic encephalopathy: correlation with neonatalmag-netic resonance imaging[J]. Pediatrics, 2000, 106(2 Pt l): 235-243.[2]王菊莉,韩玉昆.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡时程[J].新生儿科杂志, 2003, 18(3): 111-113.[3] VANNUCCIR C, VANUCCI S J. Amodel ofperinatalhypoxic-ische-mic brain damage [ J]. Ann N Y Acad Sc,i 1997, 835 ( 3 ):234-249.[4] CROLL S D, SURIC, COMPTON D L,etal. Brain derived neurotro-phic factor transgenicmice exhibitpassive avoidance deficits, increased seizure severity andin vitrohyperexcitability in the hippocampus and entorhinal cortex[J]. Neuroscience, 1999, 93(4): 1491-1506.[5] AVROVA N F, VICTOROV IV, TYURIN V A,et al. Inhibition of glutamate-induced intensification of free radical reactions by ganglio-sides: possible role in their protective effect in rat cerebellar granule cells and brain synaptosomes[J]. Neurochem Res, 1998, 23(7): 945-952.[6] SUSEN K, HEUMANN R, BLOCHLA. Nerve growth factor stimulates MAPKviathe low affinity receptor p75 (LNTR) [ J]. FEBS Lett,1999, 463(3): 231-234.[7] KAPLAN D R, MILLER F D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system[J]. CurrOpin Neurobio,l 2000, 10(3): 381-391.[8] LEE TH, KATOH, PAN LH,etal. Localization ofnerve growth fac-tor, trkA and P75 immunoreactivity in the hippocampal formation and basal forebrain of adult rats[J]. Neuroscience, 1998, 83(2): 335-349.[9] MUTOH T, HAMANO T, YANO S,etal. Stable transfection ofGM1 syn thase gene into GM1-deficientNG108-15 cells, CR-72 cells, res-cues the responsiveness ofTrk-neurotrophin receptor to its ligand, NGF[J]. Neurochem Res, 2002, 27(7-8): 801-806.
