人脑胶质瘤PTEN基因mRNA和蛋白的表达及其相关性分析

　　【摘要】 目的 探讨PTEN mRNA和蛋白在脑胶质瘤组织中的表达及临床意义，并分析其相关性。方法 分别采用反转录PCR(RTPCR)和免疫组化(IHC)方法检测PTEN在正常脑组织及不同组织学分级的人脑胶质瘤组织中的表达情况。结果 Kruskalwallis H检验显示，PTEN在脑胶质瘤组织中的表达与正常脑组织相比差异有统计学意义(P<0.01)，且随着胶质瘤恶性程度的增高，PTEN表达强度逐渐下降。结论 PTEN表达的缺失可能是脑胶质瘤发生、发展过程中极其重要的环节，PTEN可能是脑胶质瘤发生以及其预后判断的重要生物学指标。

　　【关键词】 胶质瘤;PTEN;反转录PCR;免疫组织化学

　　Relationship between the expression of PTEN mRNA

　　and protein in human brain glioma

　　MENG Xijun, LIU Yong, WANG MaoDe, XIE WanFu

　　(1. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University; 2. Department of Anatomy and Histoembryology,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To explore the clinical significance of the differential expression of PTEN in glioma tissue. Methods The mRNA and protein expressions of PTEN were assayed by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) and immunohistochemistry in 75 human brain glioma cases. Results The positive expression rate mRNA of PTEN differed significantly between brain glioma tissue and normal brain tissue (χ2=22.66, P<0.01); the expression of PTEN was significantly higher in welldifferentiated glioma than in poorly differentiated glioma. Along with the increase of glioma malignancy level, the expression intensity of PTEN decreased. Conclusion The decrease of the expression of PTEN mRNA and protein may have a very important effect on development and growth of glioma. It could be helpful in predicting the biological behavior and prognosis of glioma.

　　KEY WORDS: glioma; PTEN; reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR); immunohistochemistry

　　脑胶质瘤约占颅内肿瘤总数的40%，是危害人类健康的最常见的颅内恶性肿瘤。该肿瘤呈恶性浸润性生长，且多生长在脑部重要结构，如基底节、中央沟区、丘脑、脑干等部位，是一种极具攻击性的脑部肿瘤;同时其肿瘤细胞分化不一致,临床上可表现为不同的胶质瘤类型，呈现不同的生物学特性。因此，脑胶质瘤不仅手术难以全切，而且术后易复发、预后差，临床治愈十分困难。单纯手术治疗脑胶质瘤的5年存活率<25%，而中、远期生存率主要受术后复发及转移的困扰。因此，明确其发生、发展及侵袭转移机制是提高脑胶质瘤患者治疗效果和降低死亡率的关键。第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)是目前发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在多种组织中均有表达，其表达的异常与多种肿瘤的发生发展、侵袭转移及预后有关[13]。本研究应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和免疫组化方法检测脑胶质瘤组织中PTEN mRNA和蛋白的表达状况，探讨PTEN与脑胶质瘤的发生、发展及侵袭、转移等生物学行为的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　收集我院神经外科2007年6月至2008年6月间手术切除的脑胶质瘤标本75例。组织学分级：Ⅰ级15例，Ⅱ级22例，Ⅲ级23例，Ⅳ级15例。所有病例术前均未进行任何化学和放射治疗，术后均经病理诊断证实。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　RTPCR试剂盒购自美国Promega公司;兔源性PTEN多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品;免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。Eppendorf 5410离心机为德国Eppendorf公司产品;9700 PE基因扩增仪为美国PE公司产品;凝胶成像系统为美国BioRAD公司产品。

　　1.3 RTPCR检测PTEN mRNA的表达

　　扩增引物根据PTEN参考序列NM_000314.4设计，由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5′CTTTGTGCTGAAAGACATTATGAC3′，下游引物：5′GGCTTTGTCTTTATTTGCTTTGTC3′，扩增片段长度为792bp。以β肌动蛋白(βactin)为内参照，上游引物：5′ GTTTGAGACCTTCAACAACAC

　　CCC3′，下游引物：5′GTGGCCATCTCTCTTGCTCGAAGTC3′，扩增片段长度为320bp。逆转录反应体系25μL，扩增条件为：94℃ 1min，94℃ 30s，55℃ 45s，94℃ 1min，72℃ 1min，共35个循环，再72℃ 7min做终延伸。取PCR产物5μL，15g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线灯下观察电泳条带并进行分析。位于234bp和320bp上的条带分别为PTEN和βactin mRNA的扩增片段，如在234bp出现扩增片段则判断PTEN mRNA阳性表达，否则为阴性。

　　1.4 免疫组织化学染色

　　脑胶质瘤标本均经100mL/L的甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片厚4～5μm。载玻片经多聚赖氨酸处理，防止脱片。微波抗原修复。染色步骤按试剂盒说明书操作。PTEN抗体稀释浓度为1∶200。以PBS替代一抗作为阴性对照，用已知PTEN阳性的前列腺癌切片做阳性对照。PTEN以肿瘤细胞细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。

　　1.5 统计学分析

　　所有实验数据采用SPSS 11.5 for window统计软件分析处理。组间比较采用Kruskalwallis H检验分析，相关性分析采用Spearman检验，显著性水准为α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 PTEN mRNA和蛋白的表达

　　PTEN mRNA和蛋白表达与脑胶质瘤临床病理特征的关系见表1。Kruskalwallis H检验可见，PTEN在脑胶质瘤组织中的表达与正常脑组织相比差异有统计学中意义(P<0.01)，且随着胶质瘤恶性程度的增高，PTEN表达强度逐渐下降。同样方法分析小于5cm的胶质瘤和大于5cm的胶质瘤PTEN mRNA及蛋白的表达情况，可以看出肿瘤的大小与PTEN的表达无明显相关性(图1、图2)。表1 脑胶质瘤PTEN基因mRNA和蛋白表达与临床病理特征的关系(略)

　　2.2 PTEN mRNA与PTEN蛋白表达的相关性

　　经Spearman检验分析，PTEN mRNA的表达与PTEN蛋白的表达一致，即前者表达越强，后者表达也越强，两者呈正相关关系(r=0.99, P=0.0001)。

　　3 讨 论

　　PTEN基因，又称MMAC1或TEP1，定位于人染色体10q23.3，是1997年发现的一种与人类多种肿瘤恶性增殖与转移密切相关的肿瘤抑制基因。PTEN具有蛋白酪氨酸磷酸酶及双特异性磷酸酯酶活性，能对酪氨酸和丝(苏)氨酸进行去磷酸化作用，是迄今为止发现的第一个具有磷酸酯酶活性的抑癌基因。据目前资料显示,在多种肿瘤的发病中，PTEN基因改变主要有基因点突变和基因缺失，如拼接突变、移码突变、无义突变、错义突变、小片段缺失和小片段插入等[4]，这些都会引起PTEN的蛋白表达下降，进而使其对抗酪氨酸激酶的作用减小或消失，不能抑制细胞内某些蛋白质的酪氨酸残基磷酸化。研究表明，磷酸化和去磷酸化是多种细胞基本活动过程中起关键性作用的调节机制。PIP3作为细胞中的第二信使，是控制细胞生长的主要角色，既能刺激细胞生长，又能阻止细胞凋亡。PTEN蛋白的磷酸酯酶能使PIP3位置3上的磷酸脱磷酸化，蛋白激酶B(PKB/AKT)的活性降低，抑制细胞周期G1～S期进程，导致细胞增殖受抑,促使细胞凋亡发生[5]。PTEN表达的减少或缺失突变使基因丧失原有的功能,结果使细胞生长失去控制。此外,PTEN通过蛋白性磷酸酯酶活性抑制FAK等的磷酸化,发挥抑制细胞的迁移、铺展和粘附作用[6]。而PTEN表达的缺失将会导致FAK的磷酸化水平增高,可使肿瘤细胞的浸润能力进一步增强从而不能阻断细胞内生长信息传递,导致胶质细胞不断分裂增殖,进而形成胶质瘤[78]。本研究我们通过收集的75份脑胶质瘤病理组织，从转录水平和翻译水平研究了PTEN基因在不同分级的脑胶质瘤组织中PTEN的表达情况。实验结果显示，在Ⅰ～Ⅳ脑胶质瘤组织中PTEN的mRNA表达率分别为80%、59.1%、39.1%和33.3%;蛋白的表达率分别为80%、54.5%、39.1%和33.3%。通过Kruskalwallis H检验分析，其差别有统计学意义(P<0.05)。由此推测，PTEN表达的改变不但是肿瘤发生过程中的早期事件，而且随着组织学分级的升高，PTEN的表达呈下降趋势。说明PTEN的表达随胶质瘤组织恶性程度的变化而改变，即胶质瘤组织学分级越高其表达水平越低。提示该基因与胶质瘤的演化及侵袭进程关系密切，PTEN表达下调的脑胶质瘤更具有恶性表型和恶性行为。

　　综上所述，本研究通过对PTEN的mRNA和蛋白表达水平的研究，证实了PTEN表达的缺失可能是脑胶质瘤的发生发展过程中极其重要的环节，它可能是脑胶质瘤发生以及其预后判断的重要生物学指标。这对今后脑胶质瘤的检测和防治具有一定的指导作用。

　　【参考文献】

　　[1]XU B, YAO Q, DAI SZ, et.al. Detection of mutation and protein expression of PTEN gene in endometrial carcinoma [J]. Cancer, 2004, 23(1):6973.

　　[2]POETSCH M, LORENZ G, KLEIST B. Detection of new PTEN/MMACI mutations in head and neck squamous cell carcinomas with loss of chromosome10 [J]. Cancer Genet Cytogenet, 2002, 132(1):2024.

　　[3]NIU HL, TAO Y. Recent advances on molecular pathology of prostate carcinoma [J]. Cancer, 2003, 22(5):552556.

　　[4]SMITH JS, JENKINS RB. Genetic alterations in adult diffuse glioma: occurrence, significance, and prognostic implications [J]. Front Biosci, 2000, 5:213231.

　　[5]FURNARI FB, HUANG HJ, CAVENEE WK. The phosphoinositol phosphatase activity of PTEN mediates a serumsensitive G1 growth arrest in glioma cells [J]. Cancer Res, 1998, 58(22):50025008.

　　[6]王知力，郭双平，王文亮. PTEN基因的研究进展 [J]. 临床与实验病理学杂志, 2001, 17(4):339341.

　　[7]HLOBILKOVA A, KNILLOVA J, BARTEK J, et al. The mechanism of action of the tumor suppressor gene PTEN [J]. Biomed, 2003, 147(1):1925.

　　[8]GABARRANIECKO V, SCHALLER MD, DUNTY JM. FAK regulates biological processes important for the pathogenesis of cancer [J]. Cancer Metastasis Rev, 2003, 22(4):359374.