MGMT基因甲基化在胶质瘤化疗及预后中的意义

　　作者：黄磊　　作者单位：哈尔滨医科大学第一临床医学院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150001

　　【摘要】化疗是恶性脑肿瘤的重要辅助治疗手段之一，然而其临床效果尚不理想。肿瘤对化疗药物的耐药是影响化疗效果的重要原因。DNA修复蛋白O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶 (O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT) 在肿瘤耐药中的作用比较明确，而MGMT的表达与MGMT基因的甲基化状态密切相关。本文总结有关研究的新进展，对MGMT基因甲基化与胶质瘤化疗及预后的相关性进行综述，为实现恶性胶质瘤预见性、个体化化疗，改善病人预后等提供理论依据。

　　【关键词】 神经胶质瘤 O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶 基化

　　人脑胶质瘤是最常见的原发性恶性颅内肿瘤，治疗方法已由单一的手术治疗发展到手术加放疗和化疗等综合治疗，但胶质瘤病人的预后并没有得到明显改善。化疗是综合治疗措施中的重要步骤之一，肿瘤对化疗的耐受是影响化疗效果的重要因素之一。DNA修复酶——O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶 (O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT) 在胶质瘤组织中的表达与肿瘤的耐药性相关，且MGMT基因启动子的甲基化状态是决定MGMT表达量的主要因素，并可能影响病人的化疗效果及其预后。

　　1 MGMT基因及蛋白的结构、功能和作用特点

　　MGMT在人类由MGMT基因编码，而在细菌中由ada和ogt基因编码。人类MGMT基因定位于染色体10q24.33-qter，全长170 kb，含5个外显子，4个内含子，碱基序列中A∶C∶G∶T为1.09∶1.45∶1.07∶1。其中第1个外显子中含有较多的GC序列，但缺乏TATA盒和CAAT盒，是启动子区;在该区3'端存在一个59 bp的增强子序列，它可提高MGMT基因的转录水平;第2~5外显子为编码区，第4外显子可编码一个由5个连续氨基酸残基 (-Pro-Cys-His-Arg-VaI-) 组成的高度保守区，其中半胱氨酸残基 (-Cys-) 为甲基受体，也是蛋白酶的活性部位，存在于细菌及人类的MGMT分子中。进一步分析显示：其他DNA修复基因也显示高度的保守性，因此推断，在各种生物体中，DNA修复酶的序列高度保守是一个重要特征。MGMT的全长cDNA序列于1990年已被克隆，全长769 bp，编码区长621 bp，mRNA为1 kb，可编码207个氨基酸，相对分子质量约23 000 u，其中活性位点为145位半胱氨酸残基。

　　MGMT是一种普遍存在的DNA修复酶，可保护染色体免受烷化剂的致突变、致癌和细胞毒作用的损伤。烷化剂是一类自然界中普遍存在的重要诱变剂和致癌物质，主要造成DNA碱基的烷基化损伤 (如甲基化或乙基化)，以形成O6-甲基鸟嘌呤 (O6-mG) 对细胞危害最大，造成碱基错误配对，即G∶C→A∶T，从而引起致癌、细胞毒和骨髓抑制作用。MGMT是唯一能将O6鸟嘌呤复合物从DNA上移除的蛋白，可在突变发生前中和这种损伤作用[1]。MGMT主要通过不可逆地将烷化基团从O6-mG转移到MGMT蛋白145位的半胱氨酸残基上而保护细胞免受烷化剂的损伤[2]。在这一过程中，MGMT不需要辅助因子和其他蛋白质的参与，同一蛋白既作为甲基转移酶，又作为甲基受体蛋白。同时，MGMT 蛋白反应位点被烷化基团不可逆结合而失活，故该反应又称为自杀反应[3]。细胞对于DNA鸟嘌呤O6位上烷化基团的修复能力取决于MGMT在细胞内的含量和合成速率。

　　2 MGMT在肿瘤化疗耐药中的作用机理

　　烷化剂药物杀伤肿瘤细胞的机制已经明确，主要通过造成肿瘤细胞DNA烷基化损伤 (包括甲基化、乙基化、氯乙基化等)，进而形成DNA交联，阻断DNA复制，从而杀伤肿瘤细胞。在肿瘤细胞中，MGMT分子上有2个烷基受体，可接受烷基化损伤的细胞DNA上O6-烷基鸟嘌呤上的烷基，修复被烷基化的鸟嘌呤，因而可阻止DNA交联的形成，从而降低这些烷化剂药物的细胞毒作用。因此，对抗烷化剂药物杀伤肿瘤细胞的作用，是造成肿瘤细胞耐药的主要原因。值得注意的是，MGMT只能修复被烷化剂药物烷基化的鸟嘌呤，对已经形成交联的DNA不能修复。

　　根据MGMT酶活性的高低，可将肿瘤细胞分成两种类型：一类是无MGMT活性的细胞，即Mer-或Mex-细胞;另一类是有MGMT活性的细胞，即Mer+或Mex+细胞。两种细胞对烷化剂的细胞毒作用具有不同的敏感性。Mer-或Mex-型肿瘤细胞对烷化剂敏感，Mer+或Mex+型肿瘤细胞对烷化剂耐药，MGMT酶活性高低决定了肿瘤细胞对烷化剂是否耐药。体内外研究均证实：MGMT表达阳性的肿瘤细胞比MGMT表达阴性者对烷化剂抗癌药耐药性更强。当细胞内几乎无MGMT表达时，肿瘤细胞对烷化剂十分敏感;对烷化剂治疗显示有效的肿瘤，其MGMT表达均很低。已有研究证实，亚硝脲类药物及新药替莫唑胺 (TMZ) 的细胞毒作用主要通过DNA鸟嘌呤O6的烷基化介导，而肿瘤细胞内的MGMT可使DNA烷基化特别是甲基化损伤得到修复，是肿瘤细胞对亚硝脲类药物及替莫唑胺产生耐药的主要原因[4，5]。

　　3 MGMT基因的甲基化与MGMT蛋白的表达

　　MGMT基因和大多数管家基因一样，启动子缺少TATA盒和CAAT盒，但一些区域富含GC序列，特别是在其转录起始点区域含量约90%。MGMT基因5'端调节区域也富含GC 序列。肿瘤抑制基因和其他一些肿瘤相关基因的启动子或5'端内高度甲基化是人类肿瘤的一个共同特点，并且常常导致基因转录终止和相关蛋白丢失[6]。由于MGMT基因具有这些结构特点，故被认为其启动子中CpG岛的过度甲基化会降低基因的表达。

　　MGMT基因启动子甲基化状态与MGMT蛋白的表达关系密切，启动子甲基化是MGMT基因最常见的异常，多发生于MGMT基因启动子CpG岛，导致该基因转录停止，蛋白表达减少。Esteller等[7]分析了524例多种原发肿瘤、肿瘤细胞株和正常组织，发现所有正常组织和表达MGMT的细胞株均无MGMT基因甲基化，而不表达MGMT的细胞株均有过甲基化;同时，他们用免疫组织化学法 (IHC) 检测了31例多种原发肿瘤的MGMT表达与MGMT基因甲基化的关系，发现13例MGMT基因启动子区甲基化肿瘤中12例 (92%) 无MGMT表达，而18例无MGMT基因甲基化的肿瘤中17例 (94%) 表达MGMT。这证实了MGMT基因启动子区CpG岛甲基化是导致MGMT表达减少的重要机制。Pulling等[8]曾利用甲基化特异性聚合酶链反应 (Methylation-specific PCR，MSP) 和IHC检查239名肺腺癌病人肿瘤组织中MGMT基因甲基化和MGMT 蛋白表达的情况，结果发现MGMT基因启动子甲基化的发生率达51%，MSP和IHC检查结果的符合率达83%，证明MGMT基因启动子甲基化是细胞内缺乏MGMT蛋白的主要原因。因此，MGMT基因是目前公认的肿瘤化疗耐药基因。

　　4 MGMT与胶质瘤病人的临床特征

　　4.1 MGMT与病人的年龄、性别 MGMT基因表达与病人年龄呈负相关，男性肿瘤病人较女性肿瘤病人MGMT mRNA含量高。

　　4.2 MGMT与胶质瘤的病理类型 在不同病理类型的胶质瘤中，MGMT对化疗效果的影响也不同。在多形性胶质母细胞瘤 (GBM) 中，MGMT阳性的病人对卡莫司汀 (BCNU) 为主的化疗明显比MGMT阴性者化疗效果差。但在间变性星形细胞瘤中，MGMT表达与化疗效果的关系不密切。在成人胶质瘤MGMT活性检测中，少枝胶质细胞瘤的MGMT活性明显低于星形细胞瘤。

　　4.3 MGMT与胶质瘤的恶性程度 MGMT基因启动子甲基化发生率越高，MGMT含量越低，肿瘤恶性程度就越高。运用甲基化特异性PCR来观察脑星形细胞瘤MGMT基因启动子甲基化情况，星形细胞瘤 (WHO Ⅱ级) MGMT基因启动子甲基化程度为22 %，从低级星形细胞瘤恶化而来的胶质母细胞瘤 (WHO Ⅳ级) 甲基化程度增高，达75 %[9]。但也有一些学者持相反观点，Tanaka等[10，11]研究结果表明：高度恶性胶质瘤MGMT的表达要多于低度恶性胶质瘤。

　　5 MGMT基因甲基化与胶质瘤病人的化疗效果及其预后

　　5.1 MGMT基因甲基化与恶性胶质瘤的治疗 2005年，一项大型国际性协作研究显示：在放疗基础上加用TMZ可改善恶性胶质瘤病人的生存率 (2年生存率达46%)，从而为恶性胶质瘤提供了一种新的治疗标准[5]。这项里程碑式的研究是恶性胶质瘤治疗领域35年来取得的最重要进展[12]。此外，该研究还发现，MGMT基因是第一种可用来识别恶性胶质瘤的临床相关性分子标记物，MGMT基因沉默与TMZ疗效相关。美国临床肿瘤学会发表的2005年临床肿瘤研究进展报告，亦将其评为肿瘤临床研究十一项重大进展之一。这一突破性进展将人们的眼光聚焦在胶质瘤病人MGMT基因的甲基化上。

　　在脑胶质瘤的研究中已发现，MGMT基因启动子甲基化程度越高，预后越差，其对肿瘤病人的预后和生存期的预示作用较肿瘤的分级、临床、年龄等其他特征更有效。Hegi等[5]报道206例经TMZ治疗的胶质母细胞瘤中，MGMT基因启动子甲基化病人组生存时间明显长于非甲基化组，提示MGMT基因沉默是胶质母细胞瘤化疗效果好的因素之一。

　　5.2 MGMT基因甲基化在肿瘤组织中与在血清中的相关性 Balana等[13]研究表明：MGMT基因启动子甲基化在肿瘤组织中与在血清中具有显著的一致性。Ramirez等[14]用MSP法检测了28例胶质母细胞瘤和51例非小细胞型肺癌病人的肿瘤组织及相应血清中MGMT基因甲基化情况，发现肿瘤组织与血清中MGMT基因启动子的甲基化具有高度相关性 (Spearman检验，均P = 0.000 1)。因此，检测胶质瘤病人血清中MGMT基因启动子甲基化也可用来预测病人的预后及制定个体化的化疗方案。这也便于化疗病人定期复查，预测化疗效果，进行选择性化疗。

　　5.3 MGMT基因甲基化与少枝胶质细胞瘤化疗敏感性的关系 近年研究已证实：分子表型为1号染色体短臂 (1p) 和19号染色体长臂 (19q) 杂合性缺失 (LOH) 的少枝胶质细胞瘤化疗敏感性较好，预后也较好[15]。因此有学者尝试将染色体1p、19q LOH检测应用于少枝胶质细胞瘤的诊断、指导临床治疗和判断预后。

　　最近，Mollemann等[16]研究发现：在少枝胶质细胞瘤中，MGMT基因启动子甲基化与染色体1p、19q联合LOH高度相关，即在染色体1p、19q联合LOH的少枝胶质细胞瘤中MGMT基因较多发生甲基化;相反，MGMT基因启动子在无1p、19q联合LOH的少枝胶质细胞瘤中较少发生甲基化。这也表明MGMT基因的高甲基化及蛋白的低表达可能与少枝胶质细胞瘤的化疗敏感性有关。Brandes等[17]研究也发现：在少枝胶质细胞瘤中，MGMT基因启动子的甲基化与1p、19q LOH具有显著的一致性。因此，MGMT基因甲基化可作为一种新的候选标记物来预测少枝胶质细胞瘤病人对化疗的敏感性。

　　6 对MGMT基因甲基化检测的展望

　　MGMT基因未发生甲基化时，其编码的MGMT蛋白容易受糖皮质激素、电离辐射和有毒试剂的诱导而异常表达，所以采用IHC检测MGMT蛋白的活性并不十分可靠。因此，相对于检测MGMT蛋白的活性，检测MGMT基因的甲基化更特异、更敏感。目前，检测CpG岛甲基化的方法以甲基化敏感的限制性内切酶 (MSRE) 法和MSP法应用较多，但两者假阳性率均较高，且不适于大量样本的检测。另外，亚硫酸氢盐基因测序法结果准确，但价格昂贵，不能广泛使用。随着分子生物学技术的发展，相信会出现更准确、便捷的CpG岛甲基化检测方法，并使临床应用成为可能。

　　目前，化疗仍是肿瘤治疗的一个重要手段，在化疗之前，预先判断病人对化疗药物是否耐药是实施肿瘤预见性、个体化化疗的前提。现已证实：MGMT基因甲基化是胶质瘤化疗效果好的因素之一，并能用来预测胶质瘤病人化疗效果及其预后。因此，检测病人的MGMT基因甲基化状态，并对MGMT基因甲基化水平不同的病人，实施不同的化疗方案，实现预见性、个体化化疗，这将在提高化疗疗效，改善病人预后方面有着十分重要的意义。

　　【参考文献】

　　[1] DOLAN M E, SCHILSKY R L. Silence is golden: gene hypermethylation and survival in large-cell lymphoma [J]. J Nat Cancer Ins, 2002， 94(1): 6-7.

　　[2] PEGG A. Repair of O6-alkylguainne by alkyltransferases [J]. Mutat Res, 2000, 462(2-3): 83-100.

　　[3] BEARZATTO A, SZADKOWSKI M, MACPHERSON P, et al. Epigenetic regulation of the MGMT and hMSH6 DNA repair genes in cells resistant to methylating agents [J]. Cancer Res, 2000, 60(12): 3262-3270.

　　[4] HEGI M E, DISERENS A C, GODARD S, et al. Clinical trial substantiates the predictive value of O6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter methylation in glio- blastoma patients treated with temozolomide [J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(6): 1871-1874.

　　[5] HEGI M E, DISERENS A C, GORLIA T, et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma [J]. N Engl J Med, 2005, 352(10): 997-1003.

　　[6] HARDEN S V, TOKUMARU Y, WESTRA W H, et al. Gene promoter hypermethylation in tumors and lymph nodes of stage Ⅰ lung cancer patients [J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(4): 1370-1375.

　　[7] ESTELLER M, HAMILTON S R, BURGER P C, et al. Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia [J]. Cancer Res, 1999, 59(4): 793-797.

　　[8] PULLING L C, DIVINE K K, KLINGE D M, et al. Promo- ter hypermethylation of the O6-methylguanine-DNA methyl- transferase gene: more common in lung adenocarcinomas from never-smokers than smokers and associated with tumor progression [J]. Cancer Res, 2003, 63(16): 4842-4848.

　　[9] NAKAMURA M, WATANABE T, YONEKAWA Y, et al. Promoter methylation of the DNA repair gene MGMT in astrocytomas is frequently associated with G:C→A:T mutations of the TP53 tumor suppressor gene [J]. Carcinogenesis, 2001, 22(10): 1715-1719.

　　[10] TANAKA S, KOBAYASHI I, OKA H, et al. Drug-resistance gene expression and progression of astrocytic tumors [J]. Brain Tumor Pathol, 2001, 18(2): 131-137.

　　[11] TANAKA S, KOBAYASHI I, UTSUKI S, et al. O6-methylguanine-DNA methyltranspherase gene expression in gliomas by means of real-time quantitative RT-PCR and clinical response to nitrosoureas [J]. Int J Cancer, 2003, 103(1): 67-72.

　　[12] ASHBY L, LAROCCA R, RYKEN T. Treatment of brain tumors [J]. N Engl J Med, 2005, 352(22): 2350-2353.

　　[13] BALANA C, RAMIREZ J L, TARON M, et al. O6-methylguanine-DNA methyltransferase methylation in serum and tumor DNA predicts response to 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea but not to temozolamide plus cisplatin in glioblastoma multiforme [J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(4): 1461-1468.

　　[14] RAMIREZ J L, TARON M, BALANA C, et al. Serum DNA as a tool for cancer patient management [J]. Rocz Akad Med Bialymst, 2003, 48: 34-41.

　　[15] INO Y, BETENSKY R A, ZLATESCU M C, et al. Molecular subtypes of anaplastic oligodendroglioma: implications for patient management at diagnosis [J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(4): 839-845.

　　[16] MOLLEMANN M, WOLTER M, FELSBERG J, et al. Frequent promoter hypermethylation and low expression of the MGMT gene in oligodendroglial tumors [J]. Int J Cancer, 2005, 113(3): 379-385.

　　[17] BRANDES A A, TOSONI A, CAVALLO G, et al. Correlations between O6-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation status, 1p and 19q deletions, and response to temozolomide in anaplastic and recurrent oligodendroglioma: a prospective GICNO study [J]. J Clin Oncol, 2006, 24(29): 4746-4753.