人参总皂甙对脑出血后内源性神经干细胞增殖的影响

　　作者：施建生，高志伟，柯开富 作者单位：(南通大学附属医院神经内科，南通226001)

　　【摘要】 目的： 探讨人参总皂甙对脑出血内源性神经干细胞(NSCs)增殖的影响。方法： SD大鼠随机分为人参总皂甙和单纯脑出血组各20只，3、7、14、28、60 d各4只，应用立体定向技术，用大鼠自体尾动脉不抗凝血液75 μl缓慢注入大鼠尾状核，制成中等量脑出血模型，两组术后饲养不同时间后观察神经干细胞增殖情况，术后第1 d开始腹腔注射人参总皂甙，连续注射14 d，分别在术后3、7、14、28、60 d处死，运用免疫组织化学方法检测脑出血后各组损伤区周围神经干细胞的增殖情况。结果： 两组在3、7 d未发现NSCs增殖，14 、28、60 d组发现少量的NSCs增殖， 人参总皂甙组14、28、60 d均较单纯出血组神经干细胞明显增殖(P<0.01)。结论： 脑出血后神经干细胞被激活增殖，人参总皂甙对脑出血后神经干细胞的增殖有促进作用和改善运动功能。

　　【关键词】 神经干细胞;脑出血;人参总皂甙;大鼠

　　Effects of total saponins of panax ginseng on the expression of endogenous neural stem cells following intracerebral hemorrhage

　　Shi Jiansheng, Gau Zhiwei, Ke Kaifu (Department of Neurology,Affiliated Hospital,Nantong University.Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To explore the Effects of total saponins of panax ginseng on the proliferation of endogenous neural stem cells(NSCs) following intracerebral hemorrhage(ICH). Methods: Forty SD rats were randomized into two groups : the simple intracerebral hemorrhage group and the saponins of panax ginseng group.75μL nonanticoagulated blood was injected into the rat caudate nucleus to make the medium intracerebral hemorrhage model. The rats in both groups were raised for different time to observe the proliferation of NSCs. After operation, total saponins of panax ginseng were injected intraperitoneally for 14 days. The rats were perfused 3d、7d、14、28、60d in after operation. The immunochemistry was used to observe the proliferation of endogenous NSCs. Results: There was no proliferation of NSCs found at 3d,7d in two groups.while small amount of NSCs were found in the 14d,28d, 60d subgroups in the simple ICH group.In total saponins of panax ginseng group, There was a significant difference of the endogenous NSCs betweenthe the saponins of panax ginseng group and the simple ICH group in 14d,28d , 60d after operation(p<0.01). Conclusion: some endogenous NSCs are found in 14d,28d , 60d after the intracerebral hemorrhage.The saponins of panax ginseng induce the proliferation of endogenous NSCs in 14d ,28d ,60d and improve the neuromotor function

　　[Key words] Neural stem cells; Intracerebral hemorrhage; Ginsenoside; Rat

　　近年的研究发现哺乳动物中枢神经系统内存在具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞(neural stem cells, NSCs)，能分化为神经元和神经胶质细胞。这一发现为中枢神经系统损伤的修复研究开辟了一条全新途径。但大部分NSCs处于静止状态研究NSCs的激活、增殖与分化已成为研究的热点。

　　脑出血后神经功能恢复困难的主要原因是血肿对神经元及神经干细胞严重毁损。目前，国内己有应用NSC移植治疗脑出血的动物实验报道，但神经干细胞在脑出血治疗方面的研究尚在起步阶段。本研究通过构建大鼠脑出血动物模型，观察大鼠脑出血后不同时间病灶周边神经干细胞数量的变化;观察人参总皂甙对脑出血损伤部位内源性神经干细胞增殖的影响，为临床应用人参总皂甙治疗脑出血提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组 健康成年SD大鼠 40只，由南通大学实验动物中心提供，体重220～250 g，雌雄不拘，随机分为单纯脑出血组：3、7、14、28、60 d，5组，每组4只;人参总皂甙组：3、7、14、28、60 d，5组，每组4只。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠脑出血模型的制作 参照Rosenberg等[1]方法造模。SD大鼠腹腔注射复合麻醉剂后，将大鼠固定在立体定位仪上，以矢状线左侧3 mm,耳眼连线交点前9 mm处颅骨钻孔。取0.1 ml尾动脉血，以颅骨外板高度为零点将头皮针刺入脑内，进针深度为6 mm。将75 μl血液缓慢注入基底节区，留针10 min后缓慢拔针，骨蜡封闭骨孔后缝合头皮切口。 术后第1 d开始腹腔注射人参总皂甙(南通大学航海医学研究所提供，200每个mg/kg)，连续注射14 d。

　　模型制备成功标准：(1)出血对侧前爪不能伸直;(2)出现转圈现象;(3)行走时身体向偏瘫侧倾倒。评定大鼠运动功能参照ZeaLonga等[2]5分制评分方法：无神经功能缺损表现记0分;出血对侧前爪不能伸直则记1分;出现转圈现象者记2分;行走时身体向偏瘫侧倾倒者记3分;意识丧失，完全不能行走者记4分。1～3分为造模成功。

　　模型制备成功后，以上2组均以标准饲料喂养,自由饮水,温度20～25 ℃。分别在3、7、14、28、60 d后进行实验。

　　1.2.2 BrdU标记增殖NSCs 用胸腺嘧啶脱氧核苷类似物5-溴尿嘧啶(5-Bromo-2-Deoxyuridine, BrdU)标记处于增殖状态的NSCs，各实验组动物从脑出血模型制作成功后第2d开始腹腔注射BrdU(50 mg/kg)2次/天，间隔12 h，连续注射5 d，共10次。

　　1.2.3 免疫荧光检测BrdU阳性细胞 分别手术后3、7、14、28、60 d时，大鼠经腹腔注射复合麻醉剂，经心脏灌注100 ml生理盐水和400 ml 4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH7.4)。取脑, 后固定4 h 后入20%蔗糖0.1 mol/L PBS (pH7.4)中4 ℃过夜。次日待组织块沉底后进行连续冰冻切片, 取对耳线前10.6～9.6 mm行冠状位冰冻连续切片，片厚20 μm。分5组，每组10张，取每组的第2张作为观察切片。PBS漂洗3次，每次5 min。漂洗后的置于2N的盐酸中37 ℃、30 min，PBS漂洗3次，每次5 min。切片入封闭液，室温1 h，再入抗BrdU单克隆抗体(Sigma公司,1∶800)，室温孵育2 h后置入4 ℃的冰箱过夜。次日PBS漂洗3次，每次5 min。入结合Alexa Fluor 568 荧光素的山羊抗小鼠抗体(Invitrogen公司，1∶1000)室温孵育2 h。PBS漂洗3次，每次5 min。Hoechst33342 37 ℃(Sigma公司，5 μg/ml)孵育0.5 h。常规洗片、裱片、50%甘油PBS封片后40倍荧光显微镜下观察。

　　1.2.4 细胞计数和统计学方法 在40倍的显微镜视野下，计数损伤区周围BrdU标记阳性的NSCs数量，每张切片选择5个视野计数，每只动物观察5张切片。采用Stata7.0统计软件，对各组间BrdU标记阳性的NSCs数量进行统计学分析，计量资料以■±s表示，采用方差分析，两两比较用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠运动功能评分 单纯脑出血组：出血对侧前爪不能伸直，出现转圈现象，行走时身体向偏瘫侧倾倒。术后2 h评分为2.12±0.57，一般第7~10 d开始恢复，28 d仍有部分前爪不能伸直。人参皂甙组：术后2 h评分为2.25±0.68, 与单纯脑出血组比较P >0.05。一般第5~7 d开始恢复，28 d基本恢复正常。14、28 d后运动功能比较均显示有统计学意义,患鼠运动功能状态均有显著改善，但60 d时仍有差异(P<0.05)，见表 1。

　　2.2 组织学结果观察 单纯脑出血组和人参总皂甙组14、28、60 d组均有BrdU阳性细胞表达,阳性细胞大部分聚集在出血病灶周围，人参总皂甙组14、28、60 d均较单纯出血组NSCs明显增殖(P<0.01)，见表2和图1。

　　3 讨 论

　　缺血性脑梗死的基础研究表明，神经元再生现象仅局限于脑内某些特定区域，如海马齿状回颗粒下层、前脑室下带和大脑皮质感觉区[3]。但是这些区域仅存在极少量的NSCs，正常情况下处于静息状态，当脑内出现某些病理变化或在外界细胞因子的作用下，这些NSCs可被激活，在损伤原位增生或异位增生后向损伤部位迁移并分化[4]。如何激活这些处于静止状态的干细胞，使之增殖并替代损伤或丢失的神经元，这为中枢神经系统再生提供了一个新的思路。

　　神经元的再生过程受众多因素的影响，其中内环境中的脑原性神经营养因子和神经营养素-3能够促进神经元前体细胞的分化和成熟,睫状神经营养因子和甲状腺素3可诱导NSCs向胶质细胞分化,血小板原性生长因子可促进NSCs向神经元分化[5]。有人应用粒细胞集落刺激因子腹腔注射后5天，出血区域的特殊部位神经干细胞数量增加，并被巢素蛋白表达的增加所证实[6]。刘柏炎等[7]研究表明，脑出血后，nestin阳性细胞明显增加，在出血半球的皮质区、室旁区可见明显nestin阳性细胞表达，出血后1 h 即可见阳性细胞增加，1 d 阳性细胞数达高峰，然后逐渐降低，一直持续到第7 d，但仍然高于假手术组。而在出血区未见阳性细胞;在正常脑组织血管周围可见nestin免疫标记，脑出血后标记明显增强。本实验发现脑出血组的病灶周围区和人参皂甙组的第3、7 d未发现NSCs，这与刘柏炎等[7]研究一致。薛村水等[8]在实验性脑出血28 d后，发现病灶周围有nestin阳性细胞，大部分聚集病灶周围。胶原酶诱导的脑出血能增进内源性神经干细胞/祖细胞增殖和新生神经母细胞向出血部位的迁移[9]。有人研究发现在成人原发性基底节区和顶叶脑出血的血肿周围细胞，有神经干/祖细胞专一性蛋白标记物表达[10]。本实验在脑出血恢复期的14、28、60 d也出现BrdU阳性细胞，与薛村水等的研究相一致，且神经功能得到改善，说明神经干细胞在脑出血恢复过程中起到一定的作用。这可能与脑出血区域血液成份及损伤后体内病理生理调节所释放出的各种内源性因子等有关。由于血肿挤压效应在血肿周围存在缺血区，加之血红蛋白的释放和降解，改变了损伤区周围细胞的生存微环境，从而激活NSCs增值，但这些增殖的NSCs是分化为神经元还是神经胶质细胞，尚不清楚，需要进一步观察和研究。

　　人参是具有数千年历史的名贵中药材，对脑缺血有明显保护作用[11]。本实验应用人参皂甙对脑出血内源性NSCs增殖影响的研究发现，模型组和人参皂甙组在脑出血后第14、28、60 d在出血病灶周围均有BrdU阳性细胞，但人参皂甙组细胞数较单纯出血组明显增多(P<0.01)。14、28 d后运动功能状态均有显著改善(P<0.01)。60 d时仍有差异(P<0.05)。表明人参皂甙能促进NSCs的增殖并维持相当长的增殖期，从而进一步分化为神经元，和局部的神经元重塑突触联系，进而达到部分运动神经元的恢复。

　　【参考文献】

　　[1] Rosenberg CA, Mun-Bryce S, Wesly M, et al. Collagenase induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke, 1990, 21(5): 801-807.

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　　[8] 薛村水,刘云峰,李光来, 等. 碱性成纤维细胞生长因子对脑出血模型大鼠脑内神经干细胞增殖的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2004(2): 405-406.

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　　[11] Zhang YG, Liu TP. Protective effects of total saponins of panax ginseng on ischemia-repetfusion injury in rat brain[J]. Chinese Journal of Pharmatology and Toxicology, 1994,8(1):7-12.