低剂量伽玛刀照射对致（疒间）大鼠皮质及海马神经元c-fos和nNOS表达的影响

　　作者：梁军潮,徐波涛,杨红军,杨传红　　作者单位：

　　【摘要】目的 通过观察低剂量伽玛刀照射对致(疒间)大鼠大脑皮质及海马神经元c-fos和脑型一氧化氮合酶 (nNOS) 表达的影响，探讨伽玛刀治疗癫(疒间)的作用机制。 方法 将44只青霉素致(疒间)大鼠模型等分为实验组和实验对照组大鼠各22只，另取4只正常大鼠作为正常对照组。实验组行伽玛刀照射 (周边剂量12 Gy) 后，应用免疫组化方法，观察大脑皮质及海马神经元c-fos和nNOS表达的变化。 结果 无论是皮质还是海马，c-fos和nNOS在实验组与实验对照组动物之间，表达均有明显的差别，实验组表达明显少于实验对照组，而后者呈现双高峰现象。 结论 c-fos和nNOS在伽玛刀治疗癫(疒间)的机制中发挥了重要作用。

　　【关键词】 放射外科手术; 癫(疒间); 一氧化氮合酶; 神经元; 原癌基因蛋白质c-fos

　　Effect of low-dose Gamma knife radiosurgery on expression of c-fos and nNOS

　　in the cortex and hippocampus of experimental epileptic rats

　　LIANG Junchao1, XU Botao1, YANG Hongjun2, et al.

　　1. Department of Neurosurgery; 2. Department of Neurology, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command, Guangzhou 510010, China

　　Abstract: Objective To explore the mechanism of treatment of epilepsy with Gamma knife based on studying the effect of low-dose Gamma knife radiation on expression of c-fos and nNOS in the cortex and hippocampus of experimental epileptic rats. Methods Forty-four penicillin-induced epileptic model of rats was randomly divided into experiment group and experimental control group with 22 rats each, and the other 4 normal rats served as control group. The experimental group was irradiated by Gamma knife with a peripheral dose of 12 Gy. The expressions of c-fos and nNOS in both the cortex and hippocampus were detected using the immunohistochemical method before and after low-dose gamma knife radiation. Results After Gamma knife radiation, the expressions of c-fos and nNOS in both the cortex and hippocampus were significantly different between the experimental group and experimental control group. The former was lower than the latter, while the experimental control group showed the double-peak phenomenon. Conclusion C-fos and nNOS play important role in the mechanism of treatment of epilepsy with gamma knife.

　　Key words: radiosurgery; epilepsy; nitric-oxide synthase; neurons; proto-oncogene proteins c-fos

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料 兔抗脑型一氧化氮合酶 (nNOS)、兔抗c-fos (北京中山生物技术有限公司)，S-P免疫试剂盒、DAB (神州边新生物技术开发公司)。健康成年SD大鼠，体质量200~250 g，雌雄不拘，由第一军医大学实验动物中心提供，饲养于标准动物房。

　　1.2 方法 采用青霉素脑皮质局部浸润制作癫(疒间)大鼠模型，共44只，将其等分为两组：①实验组 (n = 22)：氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，固定于伽玛刀专用大鼠固定架 (自行设计)，进行MRI冠状位连续扫描，确定照射靶区 (右顶皮质) 三维座标。然后实施伽玛刀照射，准直器4 mm，周边剂量12 Gy，等剂量曲线50%，时间6 min。②实验对照组 (n = 22)：在麻醉下，于伽玛刀治疗室内空置6 min。另取4只正常大鼠按制作青霉素致(疒间)模型的方法处理，将青霉素改为等渗盐水，作为正常对照组 (n = 4)。对实验组和实验对照组分别于照射后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、30 d和2个月取2只动物处死，取靶区皮质及海马标本，4%中性甲醛固定液4 ℃固定16~24 h，用石蜡切片机连续切制大脑冠状切片 (厚2 μm)。每6片取1片进行免疫组化S-P法检测[1]，应用 DAB显色，每份样品同时作1份阴性对照，1份苏木精-伊红 (HE) 染色。光镜下观察并照相，计数阳性细胞。对照组动物分别在存活3 h、3 d、30 d和60 d后处死，每次1只，处理同前。

　　2 结 果

　　2.1 皮质 ①0.5~24 h：实验对照组3 h出现c-fos、nNOS阳性反应，24 h达高峰，包括神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞，见于细胞核、质 (图1);实验组表达较对照实验组减弱，阳性细胞少 (图2)。② 3~7 d：两组c-fos、nNOS阳性细胞数均有明显减少，但实验组更加明显。③14~30 d：实验对照组c-fos、nNOS阳性细胞数再度增加。30 d时，可见c-fos和nNOS阳性细胞表达为三种形式：a. 仅细胞质染色，突起也可见染色;b. 细胞核、质均有染色;c. 仅细胞核染色 (图3)。实验组阳性表达增加则不明显，特别是突起无染色 (图4)。④2个月：实验对照组靶区上述3种阳性反应更加明显，以第1种形式为主，可见大量表达的树突及轴突;实验组仅偶见阳性表达。c-fos、nNos在正常对照组均未见有意义的阳性表达。

　　2.2 海马 ①0.5~24 h：实验对照组海马CA1、CA3区及齿状回门区见到明显的c-fos、nNOS阳性神经元、神经胶质细胞和内皮细胞，实验组则较弱。②3~7 d：两组c-fos、nNOS阳性细胞均明显减少，仅偶见。③14~30 d：实验对照组在上述区域再次出现较多的c-fos、nNOS阳性表达;实验组阳性表达相对减弱。④2个月：实验对照组c-fos、nNOS阳性反应更加明显，可见到3种阳性细胞;实验组表达较少。c-fos、nNOS在正常对照组未见有意义的阳性表达。

　　3 讨 论

　　近年来，大量临床和实验研究结果均已证实，伽玛刀放射外科治疗有明确的抗癫(疒间)效应[1-2]，但对其机制的研究甚少。本实验通过检测正常大鼠和癫(疒间)大鼠在伽玛刀照射前后c-fos、nNOS表达的变化，对伽玛刀治疗癫(疒间)的机制进行探讨。

　　Talavera等[3] 研究已经证实，一氧化氮 (NO) 参与了癫(疒间)的发生和发展。一氧化氮合酶 (NOS) 是NO生成的必需酶，因此，在体内研究时往往通过测定NOS蛋白浓度来间接反映NO水平。本实验结果显示：低剂量伽玛刀照射青霉素致(疒间)大鼠后，在表现为抗癫(疒间)作用的同时，可明显抑制致(疒间)大鼠脑皮质及海马nNOS的表达，提示低剂量伽玛刀照射的抗癫(疒间)作用与其抑制脑内NO的生成有关。由于NOS的活性与胞质内Ca2+浓度升高密切相关[4]，因此，我们认为：低剂量伽玛刀照射作用于谷氨酸能神经元的N-甲基-D-天冬氨 酸 (NMDA) 受体，抑制谷氨酸的合成和释放;或通过降低谷氨酸受体的活性，减少Ca2+内流，从而间接抑制NOS的活性，使NO的生成减少，并减少对谷氨酸的正反馈作用;也可能是低剂量伽玛刀照射改变了微环境，使Ca2+离子通道改变，从而达到治疗癫(疒间)的作用。

　　c-fos在神经元活动时表达活跃，可作为神经元被激活的标志。在青霉素诱发的SD大鼠部分运动性癫(疒间)模型中，c-fos在病灶周围皮质中表达增强，3～6 h达高峰，24 h恢复到正常水平。关于c-fos表达对神经细胞损伤的影响，目前仍存在分歧，有研究认为，其对损伤后神经元的修复和生存起着积极的作用;而Smeyne等[5]利用Fos-LacZ转基因小鼠证实，持续的c-fos表达与细胞凋亡相关。

　　本实验中，正常对照组均未见到有意义的阳性结果，而实验组及实验对照组则发现c-fos呈阳性表达，并具有变化规律。从时间上分析，实验对照组的c-fos表达两次形成高峰，第1次在3~24 h，这与其他刺激诱发表达的时间相似;3~7 d阳性表达明显减少;14 d后又明显增加，形成第2次高峰，这可能与14 d后靶区细胞逐渐凋亡坏死，其内环境的变化及产物形成一个新的刺激原有关，其因素较为复杂。伽玛刀照射30 d时，可见c-fos和nNOS阳性细胞表达为三种形式，原因可能是c-fos作为细胞的第3信使，其DNA位于胞核内，受到诱导后mRNA由细胞核进入细胞质，并在其内合成c-fos蛋白，后者与Jun蛋白交联成二聚体，磷酸化后进入细胞核，从而发挥生理功能。这一过程包括三个阶段，即c-fos mRNA由细胞核进入细胞质、在细胞质内合成蛋白、蛋白重新进入细胞核。

　　采用免疫组化检测显示的通常是进入细胞核的蛋白，本研究中多数阳性细胞显示出胞核。部分细胞的胞核和胞质均反应为阳性，说明在细胞质内合成的蛋白一部分已进入细胞核，一部分仍留在细胞质。至于细胞核未染色而仅细胞质及突起染色呈阳性的细胞，说明合成的蛋白已由细胞核进入细胞质。此时，在细胞质合成蛋白的过程是正常的，而合成后的蛋白未能进入胞核，滞留在胞质及突起内，这时的蛋白是没有生理功能的。

　　本研究发现，癫(疒间)后的c-fos阳性表达在受到伽玛刀低剂量照射后呈减弱趋势，且出现在癫(疒间)发作14 d以后，随存活期延长而有所增加。因此，我们推测：胞核未染色而细胞质及突起明显染色的细胞是损伤严重的细胞，细胞核染色而细胞质未染色者是正常反应细胞，均染色者为中间状态。

　　细胞质和树突c-fos阳性表达的原因可能由其c-fos原癌基因C-末端突变所致[6]。c-fos蛋白滞留于细胞质与树突的意义可能表明了细胞的损伤及其对损伤的反应。也有研究报道c-fos样免疫阳性物质不仅见于细胞核，也见于细胞质，但该作者没有对其做出合理的解释[7]。

　　多项研究表明：长进程的c-fos表达与程序化的神经细胞死亡有关[6]。因此，本研究中所见到的c-fos表达细胞不仅提示这些细胞有应激反应，也提示这些细胞受到了损伤。Dragunow等[8]报道，在数个脑区，c-fos阳性细胞在寒冷环境下暴露14 d时较暴露3 h和24 h时明显增多，这为一些即刻早期基因为什么会有2次表达高峰提供了依据。

　　必须指出的是，伽玛刀治疗癫(疒间)应该是多种途径共同作用的结果，单单从nNOS和c-fos进行解释必定是片面的。本实验结果只是表明：nNOS和c-fos参与了伽玛刀治疗癫(疒间)的机制，而其基因水平机制仍需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 徐波涛, 梁军潮, 王伟民, 等. 伽玛刀治疗顽固性癫(疒间) (附166例分析) [J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2007, 12(4): 148-150.

　　[2] 梁军潮, 徐波涛, 王伟民, 等. PET 与MEG定位伽玛刀治疗顽固性癫(疒间)临床及脑电图研究 [J]. 立体定向和功能性神经外科杂志, 2007, 20(3): 144-147.

　　[3] TALAVERA E, MARTINEZ-LORENZANA G, CORKIDI G, et al. NADPH-diaphorase-stained neurons after experimental epilpesy in the rats [J]. Nitric Oxide, 1997, 1(6): 484-493.

　　[4] MURASHIMA Y L, YOSHII M, SUZUKI J, et al. Ictogenesis and epileptogenesis in EL mice [J]. Epilepsia, 2002, 43 (Suppl 5): 130-135.

　　[5] SMEYNE R J, VENDRELL M, HAYWARD M, et al. Continuous c-fos expression precedes programmed cell death in vivo [J]. Nature, 1993, 363(6425): 166-169.

　　[6] PIECHACZYD M, BLANCHARD J M. C-fos proto-oncogene regulation and function [J]. Crit Rev Oncol Hematol, 1994, 17(2): 93-131.

　　[7] WU Y P, TAN C K, LING E A. Expression of Fos-like immunoreactivity in the brain and spinal cord of rats following middle cerebral artery occlusion [J]. Exp Brain Res, 1997, 115(1): 129-136.

　　[8] DRAGUNOW M, BEILHARZ E, SIRIMANNE E ,et al. Immediate-early gene protein expression in neurons undergoing delayed death, but not necrosis, following hypoxic-ischaemic injury to the young rat brain [J]. Brain Res Mol Brain Res, 1994, 25(1-2): 19-33.