伽玛刀照射正常大鼠海马组织形态学结构的变化

　　作者：张建国,孟凡刚,*刘阿力,王忠诚,张颖　　作者单位：首都医科大学附属北京天坛医院 1. 神经外科;2. 北京市神经外科研究所 北京 100050

　　【摘要】目的 研究伽玛刀照射对正常大鼠海马组织形态学结构的影响。 方法 利用自行设计的伽玛刀大鼠立体定位头架，分别应用剂量为20、40、60、80、100和150 Gy的伽玛射线对大鼠海马组织进行照射。采用电镜观察照射后海马神经细胞超微形态结构变化，MRI观察影像学表现。 结果 电镜结果显示：100 Gy和150 Gy剂量引起海马神经细胞严重损伤，60 Gy引起轻度损伤，在40 Gy时胶质细胞和血管内皮细胞已有肿胀。100 Gy照射后，1个月内大鼠靶区无影像学改变，3个月时大鼠靶区表现为高信号。 结论 海马组织的损伤程度与伽玛刀的照射强度存在剂量-效应关系和时间-效应关系，海马神经元比胶质细胞和血管内皮细胞更具放射耐受性。

　　【关键词】 放射外科手术; 海马; 组织学

　　Morphological changes of the hippocampal tissue irradiated by Gamma knife in rats

　　ZHANG Jianguo1，2, MENG Fangang2, LIU Ali2, et al

　　1. Department of Neurosurgery; 2. Beijing Neurosurgical Institute, Beijing Tiantan Hospital, Capital University of Medical Sciences,

　　Beijing 100050, China

　　Abstract: Objective To investigate radiobiological response of the normal rat hippocampus irradiated by Gamma knife. Methods The hippocampus of rats was irradiated by Gamma knife with self-designed stereotactic lathe-head for rats at doses of 20, 40, 60, 80, 100 and 150Gy. Changes in morphology of ultrastructures of the neural cells were observed under electron microscope, and imaging features were noted by MRI. Results Electron microscopy showed serious neural damage in 100 and 150Gy, mild damage at 60Gy, and mild swelling of glial cells and endotheliocytes at 40Gy. At dose of 100Gy, MRI showed no changes in the first month, and high signal intensity at the third month. Conclusion Dose-response and time-response relationships exist between injury severity of the hippocampal tissue and intensity of Gamma irradiation in the model of irradiation, and hippocampal neurons are less radiosensitive than glial cells and endotheliocytes.

　　Key word: radiosurgery; hippocampus; histology

　　本研究利用自行设计的伽玛刀大鼠立体定位头架，应用不同剂量的伽玛刀射线对正常大鼠海马组织进行照射，研究照射后海马神经细胞的形态结构变化和影像学变化，旨在探讨伽玛刀作用于正常海马组织的机制，了解正常海马组织对伽玛刀的耐受剂量，为颅内功能性疾病的治疗、正常脑组织的保护及并发症的防治等提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验设计 本研究根据大鼠脑立体定向图谱[1]，设计了伽玛刀大鼠立体定位装置。该装置包括大鼠脑立体定位头架、连接装置和伽玛刀立体定位头架三部分。首先按照大鼠脑立体定位解剖图谱明确需要毁损的靶点，通过大鼠脑立体定位头架计算靶点坐标，然后将立体定位头架中固定大鼠的装置连同大鼠一起转移并固定于伽玛刀立体定位头架上，最后明确伽玛刀立体定位头架的圆点与大鼠前囟的关系，计算出靶点在伽玛刀立体定位头架中的坐标值，最终将此数值输入计算机中制定治疗计划。体质量200~250 g的健康雄性Wistar大鼠由中国医学科学院动物所提供，水合氯醛腹腔注射麻醉 (300 mg/kg体质量) 后，大鼠头部固定于立体定位架上。切开头皮，暴露前囟，测量靶点在X、Y和Z轴上的数值，确定靶点在伽玛刀立体定位头架的坐标位点，将数值输入Leksell Gamma Plan剂量设计系统，应用瑞典ELEKTA公司生产的B型Leksell伽玛刀进行照射 (图1)，准直器为18 mm。

　　1.2 海马神经元超微结构观察 实验动物随机分为7组，每组2只。6个实验组伽玛刀照射剂量分别为20、40、60、80、100和150 Gy，1个对照组不照射。照射点为腹侧海马，坐标：前囟后5.8 mm，深5.2 mm，中线旁5 mm。伽玛刀照射后48 h取材。大鼠经水合氯醛麻醉，经升动脉分别用生理盐水、4%多聚甲醛灌注后取脑，固定2 h，将靶点海马组织切成1 mm小块，置于2.5%戊二醛内室温固定2 h，PBS冲洗10 min × 3，组织块经固定、漂洗、脱水、浸透、包埋和固化、超薄切片及染色，制成电镜标本，在透射电镜下观察神经细胞、胶质细胞、毛细血管和神经纤维的超微结构。

　　1.3 影像学检查和组织学观察 实验动物随机分为8组，每组2只;7个实验组伽玛刀照射剂量均为100 Gy，1个对照组不照射。照射点为背侧海马，靶点坐标为前囟后3.5 mm、深2 mm，中线旁3 mm。①影像学检查：分别于照射后7 d、15 d、1个月、2个月和3个月行MRI检查，场强0.5 T，线圈为膝关节线圈，行轴位和冠状位无间距扫描，层厚0.2 mm。②组织学观察：7个实验组于照射后1 d、3 d、7 d、15 d、1个月、2个月和3个月后取材，按上述步骤取脑，经石蜡包埋后，经苏木素-伊红染色、Nissl染色，行组织学观察。

　　2 结 果

　　2.1 海马组织超微结构的变化

　　2.1.1 150 Gy组： 海马神经细胞肿胀明显，细胞质呈空泡样改变，胞核变形，核膜不清，核间隙及内质网显著扩张，线粒体肿胀成空泡样变 (图2)。多聚核糖体解聚，神经突触亦有变化，突触后膜增厚，囊泡增多，突触前膜肿胀。星形胶质细胞病变严重，胞质水肿，细胞器减少，出现大片空白区，残留线粒体肿胀。毛细血管内皮细胞肿胀并突入管腔，管周形成较大空泡，基膜增厚并弯曲，部分基膜厚度不均。周细胞肥大变性，细胞质内含较多吞噬体。

　　2.1.2 100 Gy组： 神经细胞核形态不规则，核膜内凹，胞体肿胀，细胞质内线粒体空泡样变，嵴有断裂或消失，轴索轻度肿胀。星形胶质细胞肿胀明显，细胞质空泡样变，线粒体肿胀，神经突触轻度肿胀，囊泡内电子密度增高，毛细血管内皮细胞肿胀，管腔周围空泡样变，基膜增厚，周细胞水肿伴空泡化 (图3)。

　　2.1.3 80 Gy组： 神经细胞轻度肿胀，核不规则，核膜轻度内陷，细胞质内线粒体肿胀，部分空泡样变，内质网轻度扩张。胶质细胞肿胀严重，细胞质空泡样变，核异型，线粒体肿胀。神经突触肿胀不明显。毛细血管内皮细胞肿胀，管周空泡样变，周细胞轻度肿胀 (图4)。

　　2.1.4 60 Gy组： 部分神经细胞轻度肿胀，胞核无明显变化，细胞质内线粒体轻度肿胀，部分内质网扩张，细胞质空泡样变不显著，神经突触无变化。星形胶质细胞肿胀和细胞质空泡样变，线粒体轻度肿胀，嵴电子密度增高。毛细血管内皮细胞肿胀，血管周围有小空泡但尚未融合成大空泡。

　　2.1.5 40 Gy组： 神经细胞未见肿胀，核形态基本正常，少数线粒体肿胀，嵴电子密度增高。部分星形胶质细胞肿胀，细胞质内有小空泡形成，线粒体轻度肿胀，内质网部分扩张。毛细血管内皮细胞轻度肿胀，管腔不规则，管周有部分小空泡样变。

　　2.1.6 20 Gy组： 神经细胞正常，胞核完整，线粒体嵴电子密度略增高，内质网无明显变化，星形胶质细胞偶有肿胀。细胞核无变化，毛细血管内皮细胞偶有肿胀，管腔不规则，管周空泡样变少见。

　　2.1.7 对照组： 神经元、神经突触、星形胶质细胞和毛细血管无变化 (图5)。

　　2.2 大鼠海马组织照射后的影像学检查 MRI T2加权像扫描结果显示：剂量为100 Gy的伽玛射线照射后，1个月内大鼠靶区无影像学改变，2个月时显示为混杂密度，可能为出血和肿胀所致;3个月时表现为明显的高信号，边界清楚，直径约0.5 cm (图6)。

　　2.3 组织学观察 剂量为100 Gy的伽玛射线照射后，7 d以下者照射部位无明显组织学改变;照射后15 d，大鼠损伤区中部有部分神经元缺失，但不明显;照射后1个月，肉眼观察未见病理改变，镜下观察未见坏死灶和出血性改变，但与对侧非照射区相比，有明显的神经元缺失现象;照射后2个月，肉眼见损伤区中部坏死软化伴出血灶，光镜下为坏死区和周围炎性反应;3个月，肉眼见靶区出现凝固性坏死灶，呈圆形，直径约0.5 mm，与MRI结果一致。

　　3 讨 论

　　我们自行设计了不用MRI或CT引导的大鼠伽玛刀立体定位头架，为应用伽玛刀进行大鼠脑组织解剖靶点的照射提供了方便。该头架虽不用MRI和CT引导，但经解剖和MRI影像结果证实，照射靶点准确，完全能满足实验要求。

　　一般认为：成年动物的神经组织对放射线有较高的耐受性。本研究显示：海马组织的损伤程度与伽玛刀照射强度存在剂量-效应关系和时间-效应关系;神经细胞比胶质细胞和血管内皮细胞对放射线具有更强的耐受性。电镜超微结构显示：80 Gy时，海马神经元轻度肿胀，核不规则，但细胞的膜性结构如线粒体、内质网等损伤严重;当照射剂量降至60 Gy时，大部分神经元形态结构正常，少数神经元轻度肿胀，膜结构损伤也较轻;而40 Gy时神经元未见损伤，细胞核无变化，仅有部分线粒体电子密度增高，而胶质细胞和毛细血管内皮细胞依然有不同程度的肿胀，但细胞器未见损伤;即使是照射剂量为150 Gy和100 Gy时，胶质细胞和血管内皮细胞也比神经元损伤严重，细胞质水肿并形成大片空白区，细胞器很少残留且肿胀明显，血-脑屏障已被严重破坏，神经突触表现为突触后膜增厚，囊泡增多，突触前膜肿胀等 (其他照射剂量对神经突触损伤较轻);20 Gy时，星形细胞和血管内皮细胞稍有肿胀，管腔周围偶有空泡变，神经细胞除线粒体电子密度略高外，胞核完整，内质网无明显变化。

　　研究表明[2]：脑肿瘤行20~200 Gy照射后，靶组织中的增殖细胞、内皮细胞、少突胶质细胞和瘤细胞对伽玛射线反应不同。少突胶质细胞的放射性坏死将引起神经束的脱髓鞘变性和白质坏死，同时可有内皮细胞损害和微循环障碍。一次性大剂量照射也可直接导致内皮细胞损害和血-脑屏障损害，从而导致神经元变性和灰质坏死。

　　本实验结果表明：神经细胞与胶质细胞和血管内皮细胞比较，对放射线具有更强的耐受性，尤其是细胞核比由细胞膜结构组成的细胞器对放射线具有更高的耐受性。高剂量 (100 Gy和150 Gy) 可直接引起神经细胞损伤，而低剂量 (40 Gy和20 Gy) 对胶质细胞和血-脑屏障破坏较重，但这些组织和结构的损伤有可能引起神经元的继发性损伤。我们既往的研究表明：低剂量 (30 Gy) 即可引起培养的海马神经细胞损伤和死亡[3]。分析原因，可能是由于脑组织受到伽玛射线照射后的反应与培养细胞出现的反应不同，脑组织受神经和内分泌的影响，所发生的反应非单一性效应，低剂量照射导致胶质细胞和血管内皮细胞损伤，这些损伤虽然可能引起神经元的继发性损伤，但对神经细胞也可能有保护和损伤修复作用。 其确切的作用机制尚有待进一步深入研究。

　　研究表明：癫病人可有局灶性MRI变化[4]，MRI亦常用于癫病人的术前检查。但关于海人酸诱导大鼠癫模型的MRI表现仍知之甚少[5]。T2加权相对水肿敏感，在杏仁核点燃的癫大鼠模型中，MRI-T2加权相信号增强[6]。本研究观察了100 Gy照射剂量、4 mm准直器照射引起的组织形态学和影像学变化，MRI示照射后1个月内大鼠靶区无影像学改变，2个月时为混杂密度，3个月时为明显的高信号，此时解剖见靶区凝固性坏死并已液化，说明MRI表现与组织学变化一致[7]。

　　【参考文献】

　　[1] PAXINOS G, WATSON C. The rat brain in stereotaxic coordenates [M]. 2nd ed. New York: Academic Press, 1986: 1-104.

　　[2] LUNSFORD L D, ALTSCHULER E M, FLICKINGER J C, et al. In vivo biological effects of stereotactic radiosurgery: a primate model [J]. Neurosurgery, 1990, 27(3): 373-382.

　　[3] 刘阿力, 张建国, 王忠诚, 等. 伽玛刀照射培养的海马神经元形态结构的变化 [J]. 中华医学杂志, 1998, 78(8): 624- 626.

　　[4] SZABO K, POEPEL A, POHLMANN-EDEN B, et al. Diffusion-weighted and perfusion MRI demonstrates parenchymal changes in complex partial status epilepticus [J]. Brain, 2005, 128(6): 1369-1376.

　　[5] FABENE P F, MARZOLA P, SBARBATI A, et al. Magnetic resonance imaging of changes elicited by status epilepticus in the rat brain: diffusion-weighted and T2-weighted images, regional blood volume maps, and direct correlation with tissue and cell damage [J]. Neuroimage, 2003, 18(2): 375- 389.

　　[6] JUPP B, WILLIAMS J P, TESIRAM Y A, et al. Hippocampal T2 signal change during amygdala kindling epileptogenesis [J]. Epilepsia, 2006, 47(1): 41-46.

　　[7] NAIRISMAGI J, PITKANEN A, KETTUNEN M I, et al. Status epilepticus in 12-day-old rats leads to temporal lobe neurodegeneration and volume reduction: a histologic and MRI study [J]. Epilepsia, 2006, 47(3): 479-488.