荧光-磁共振双功能纳米探针标记9L胶质瘤细胞

　　作者：孟祥喜,万家齐,张文凯,景猛　　作者单位：1. 哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150001; 2. 哈尔滨工业大学材料学院， 黑龙江 哈尔滨 150001; 3. 龙华人民医院神经外科， 广东 深圳 518000; 4. 哈尔滨医科大学附属第四医院神经外科，

　 【摘要】目的 验证9L胶质瘤细胞能否被荧光-磁共振双功能纳米探针特异性、高效性地标记，及标记后能否被光学成像和MRI检出。 方法 将超顺磁性氧化铁纳米粒子 (SPIO) 与异硫氰酸荧光素 (FITC) 和氯霉素 (Chlorotoxin) 耦联，合成荧光-磁共振双功能纳米探针 (SPIOFC)。9L胶质瘤细胞分别与SPIOFC和SPIOF (SPIO-FITC) 共培养;同时将神经细胞与SPIOFC共培养，作为胶质瘤细胞的对照。采用普鲁士蓝染色和MRI评价胶质瘤细胞吞噬SPIOFC的情况，并在激光扫描共聚焦显微镜下评价SPIOFC的光学显像能力。 结果 与SPIOFC共培养的9L胶质瘤细胞的普鲁士蓝染色阳性细胞比例为 (99.1 ± 1.0)%明显高于与SPIOF共培养的9L胶质瘤细胞的 (4.0 ± 1.8)%。与SPIOFC共培养9L胶质瘤细胞的T2信号强度为 (210.8 ± 20.2) 明显低于与SPIOF共培养的9L胶质瘤细胞 (2 245.8 ± 213.3)。与SPIOFC共培养9L胶质瘤细胞比较，与SPIOFC共培养神经细胞的普鲁士蓝染色阳性细胞比例 (0) 及T2信号强度 (2 533.7 ± 199.2) 的差异有统计学意义。在激光扫描共聚焦显微镜下，被胶质瘤细胞吞噬的SPIOFC发出绿色荧光。 结论 SPIOFC是一个特异性、高效性的9L胶质瘤细胞靶向探针。以SPIOFC为探针，能在MRI和光学显微镜下有效地辨别9L胶质瘤细胞与神经细胞。

　　【关键词】 神经胶质瘤; 超顺磁性氧化铁; 纳米粒子; 磁共振成像; 显微镜检查，荧光

　　Specific targeting of 9L glioma cells with bifunctional optical and MRI nano-probe

　　MENG Xiangxi1, WAN Jiaqi2, ZHANG Wenkai3, et al

　　1. Department of Neurosurgery, First Hospital Affiliated to Harbin Medical University, Harbin 150001, China; 2. Materials Science and Engineering College, Harbin Industry University, Harbin 150001, China; 3. Department of Neurosurgery, Longhua People's Hospital,

　　Shenzhen 518000, China

　　Abstract: Objective To determine whether 9L glioma cells can be specifically and efficiently targeted by bifunctional optical and MRI nano-probe, and whether 9L glioma cells can be detected by MRI and optical imaging. Methods SPIOFC was synthesized by conjugating superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIO) with fluorescein isothiocyanate (FITC) and chloromycetin. 9L glioma cells were cultured with SPIOFC and SPIOF (SPIO-FITC) respectively, and neural cells were treated with SPIOFC as control for SPIOFC-targeted glioma cells. The internalization of SPIOFC by glioma cells was assessed by Prussian blue staining and MRI. The optical imaging ability of SPIOFC was evaluated by confocal laser scanning microscopy. Results Percentage of Prussian blue staining positive cell in the 9L cells cultured with SPIOFC (99.1% ± 1.0 %) were significantly more than those in the 9L cells incubated with SPIOF (4.0% ± 1.8 %). The T2 signal intensity of 9L cultured with SPIOFC (210.8 ± 20.2) were substantially lower than those of 9L cells incubated with SPIOF (2 245.8 ± 213.3). There were significant differences in percentage of Prussian blue staining positive cell (0) and T2 signal intensity between SPIOFC-treated 9L cells and SPIOFC-treated neural cells (2 533.7 ± 199.2). SPIOFC internalized by glioma cells exhibited green fluorescence under confocal laser scanning microscope. Conclusion SPIOFC is suitable for specific and efficient targeting 9L glioma cells. MRI and optical imaging in conjunction with SPIOFC can distinguish glioma cells from normal brain tissue cells.

　　Key words: glioma; superparamagnetism iron oxide; nanoparticles; magnetic resonance imaging; microscopy, fluorescence

　　准确辨别胶质瘤与周围正常脑组织，对精确地切除肿瘤至关重要。本研究旨在合成可特异性、高效性标记胶质瘤的荧光-MRI双功能纳米探针，以期在术前、术中能更准确地显示胶质瘤。

　　1 材料与方法

　　1.1 双功能纳米探针 (SPIOFC) 的合成 SPIOFC由超顺磁性氧化铁纳米粒子 (SPIO)、异硫氰酸荧光素 (FITC，Sigma) 和氯霉素 (Cltx，AnaSpec) 合成。水溶性SPIO按本研究组报道的方法合成[1，2]，直径约7 nm。应用sol-gel方法[3]，将SPIO包裹于FITC-二氧化硅壳中，从而形成荧光和磁共振双功能核-壳结构的纳米探针-SPIOF (SPIO-FITC)。氨基化SPIOF通过将3-aminopropyl-triethoxy-silane (APS，Sigma) 溶解于SPIOF混悬液中获得。使用标准共价耦联方法[4]，将Cltx与SPIOF表面的氨基共价耦联，从而合成了SPIOFC。SPIOFC的形态学特征使用透射电子显微镜 (TEM，Philips Tencai 20) 观察。探针上Cltx的数量使用蛋白质分析BCA kit (Sigma) 计算。

　　1.2 细胞及细胞培养 9L胶质瘤细胞由河本圭司教授 (日本关西医科大学神经外科) 提供，使用含10%胎牛血清的DMEM培养液 (Gibco) 常规培养。神经细胞参照以往方法[5]由新生Wistar大鼠 (哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供) 大脑皮质获得。仔细去除大鼠脑皮质上的脑膜及血管，胰酶消化20 min，培养液终止消化，1 000 rpm离心5 min，弃上清液后加入培养液轻轻反复吹打，至液体均匀后于200目铜网过滤，使用含10%胎牛血清和2% B-27的DMEM-F12培养液常规培养，换液1次/3 d。

　　1.3 普鲁士蓝染色 行普鲁士蓝染色以判定细胞内铁是否存在。以每孔浓度3 × 105个将细胞接种于6孔板中。接种后24 h，9L胶质瘤细胞分别与SPIOFC和SPIOF (100 mg Fe/L) 共培养1 h。接种后7 d，神经细胞与SPIOFC (100 mg Fe/L) 共培养1 h。共培养后标本用培养液和PBS缓冲液分别冲洗2次，然后用4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后用普鲁士蓝溶液 (等体积的6%盐酸和2%亚铁氰化钾) 染色30 min，核固红复染。计算随机视野 (200 ×) 下普鲁士蓝染色阳性细胞百分比，每个标本随机抽取20个视野。

　　1.4 MRI像 先将2 × 106个细胞均匀混悬于100 μl 4 %明胶中，再将细胞悬液置入96孔板，每孔100 μl，4 ℃下使其凝固。为更好地采集图像，孔板周围间隙充满去离子水。采用1.5TMRI (东芝 VISART) 进行扫描，配以人膝部线圈。扫描序列为自旋回波T2加权像 (SE T2WI)：TR 3 000 ms，TE 20 ms，矩阵256 × 192，扫描野 (FOV) 15 cm × 15 cm，层厚 2.5 mm。使用MRI配备的图像计量工具测量标本中心0.12 cm2的区域 (Regions of interest，ROIs)，从而获得标本的信号强度。

　　1.5 激光扫描共聚焦显微镜检查 以每孔浓度1 × 105个将9L细胞接种于盖玻片。接种后24 h，9L细胞与SPIOFC (100 mg Fe/L) 共培养1 h。共培养后标本用培养液和PBS缓冲液分别冲洗2次。被标记的细胞使用Zeiss LSM 510 META 激光扫描共聚焦显微镜采集共聚焦影像。用氩离子激光器 (488 nm) 激发FITC的绿色荧光 (510~525 nm)，以评价探针的光学显像能力。

　　1.6 统计分析 数据以均数 ± 标准差 (x ± s) 表达。采用Kruskal-Wallis 检验行统计学分析，以P <0.012 5为具有统计学差异。

　　2 结 果

　　2.1 SPIOFC的性状 (图1) 核-壳结构的SPIOFC由以SPIO构成的核与均质的二氧化硅壳组成，直径约80 nm。使用BCA kit行蛋白质分析，结果SPIOFC上Cltx分子的平均数量约为50.2。

　　2.2 普鲁士蓝染色 SPIOFC 和 SPIOF呈蓝染颗粒，位于细胞质内。与SPIOFC共培养的9L细胞 (图2A) 细胞质内含大量的蓝染颗粒，说明9L细胞吞噬了大量的SPIOFC，普鲁士蓝染色阳性细胞的百分比为 (99.1 ± 1.0)%;而与SPIOF共培养的9L细胞 (图2B) 细胞质内几乎无蓝染颗粒，普鲁士蓝染色阳性细胞百分比为 (4.0 ± 1.8)%;两组比较，差异具有统计学意义 (P <0.012 5)。染色结果提示：9L细胞能特异性、高效性地吞噬SPIOFC，而不能特异性、高效性地吞噬SPIOF。

　　与SPIOFC共培养的9L细胞 (图2A) 吞噬了大量SPIOFC，而与SPIOFC共培养的神经细胞 (图2C) 不吞噬SPIOFC，普鲁士蓝染色阳性细胞百分比为0;两组比较，差异具有统计学意义 (P <0.012 5)。染色结果提示：SPIOFC能特异性、高效性地被9L细胞吞噬，而不能被神经细胞吞噬。

　　2.3 MRI MRI结果与普鲁士蓝染色结果一致。与SPIOFC共培养的9L细胞 (图3A) 和与SPIOF共培养的9L细胞 (图3B) 比较，显示了更强的MRI阴性对比性，前者T2信号强度 (210.8 ± 20.2) 低于后者 (2 245.8 ± 213.3)，差异具有统计学意义 (P <0.012 5)。MRI结果同样提示：9L细胞能特异性、高效性地吞噬SPIOFC，而不能特异性、高效性地吞噬SPIOF。

　　与SPIOFC共培养后，9L细胞 (图3A) 比神经细胞 (图3C) 显示了更强的MRI阴性对比，9L细胞的T2信号强度明显低于神经细胞 (2 533.7 ± 199.2) 的T2信号强度;两组比较，差异具有统计学意义 (P <0.012 5)。这些结果同样提示：SPIOFC能特异性、高效性地被9L细胞吞噬，而不能被神经细胞吞噬;用SPIOFC作为MRI对比剂，MRI具有将胶质瘤与正常脑组织区分的潜力。

　　2.4 激光扫描共聚焦显微镜检查 (图4) SPIOFC发出的绿色荧光位于细胞内，从中层到上层和下层荧光强度逐渐减弱，说明9L细胞吞噬了SPIOFC，SPIOFC有显示胶质瘤的光学显像能力。

　　3 讨 论

　　准确辨别胶质瘤与周围正常脑组织是彻底切除肿瘤的前提。然而应用钆螯合物作为对比剂的MRI，所显示的肿瘤与其周围正常脑组织的拙劣对比严重限制了肿瘤切除的彻底性[6]。SPIO作为一种MRI对比剂，已被广泛应用[7，8];同时也被用于标记胶质瘤细胞，以便MRI在真正的细胞水平显示胶质瘤[6，9-11]。为使术前MRI与术中光学成像相互关联，以便更好地指导术中肿瘤切除，SPIO与荧光基团相耦联形成的一种光学和MRI双功能探针被用于胶质瘤显像及手术切除[12]。然而胶质瘤细胞内吞SPIO的特异性低，限制了SPIO的应用。SPIO不但被胶质瘤细胞吞噬，而且也被反应性星形细胞及巨噬细胞吞噬[6，12，13]，从而造成了对肿瘤范围的过大估计。因此，为了获得胶质瘤细胞的特异性识别及SPIO的高效性内吞，需要研制一种新颖的、能特异性靶向胶质瘤的光学和MRI双功能SPIO纳米探针。

　　纳米粒子能通过受体介导的内吞作用被细胞吞噬[14]，有些基团能通过受体介导的内吞作用被靶细胞优先、高效地吞噬。实现纳米粒子特异性、高效性内吞的一种方法是用上述基团修饰纳米粒子表面[15，16]。Cltx是一个由36个氨基酸组成的小肽，最初是从以色列蝎子的毒液中提取出来。Cltx在胶质瘤细胞表面的特异性受体被证明是膜结合的基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2，MMP-2)，MMP-2可与Cltx高亲和性地结合[17]。MMP-2在胶质瘤和其他神经上皮来源的肿瘤中呈特异性高表达，而在非神经上皮来源的肿瘤和正常脑组织中不表达[18]。因此Cltx能够高特异性、高选择性地靶向结合胶质瘤[19]，使用Cltx修饰SPIO可能有利于提高胶质瘤吞噬SPIO的特异性和效率。因此本实验的目的是：① 9L胶质瘤细胞能否特异性、高效性地吞噬SPIOFC。② SPIOFC被9L胶质瘤细胞吞噬后能否被MRI和光学成像检出。本实验结果证明：SPIOFC是一个特异性的、高效性的胶质瘤靶向探针，MRI和光学成像能有效地检出被SPIOFC标记的9L胶质瘤细胞。

　　本实验中，9L胶质瘤细胞吞噬了大量的SPIOFC，而几乎不吞噬SPIOF。此外，与9L胶质瘤细胞比较，神经细胞不吞噬SPIOFC。这说明SPIOFC能特异地、高效地标记9L胶质瘤细胞。SPIOFC能在细胞水平将胶质瘤与正常脑组织区分，Cltx应该是SPIOFC具有这一卓越能力的原因。MMP-2是Cltx的特异性受体，仅存在于胶质瘤细胞的细胞膜上，而在正常脑组织细胞不表达。通过Cltx与胶质瘤细胞表面MMP-2的紧密结合，SPIOFC以受体介导的内吞方式，穿越胶质瘤细胞膜而进入细胞质。我们推测：SPIOF很难与胶质瘤细胞表面结合，SPIOFC也很难与正常脑组织细胞表面结合。更重要的是，以SPIOFC作为探针，9L胶质瘤细胞的MRI和光学影像与神经细胞的MRI和光学影像有明显不同。因此，MRI和光学成像可能是一种可行的、有效的工具，可在术前和术中在细胞水平甄别胶质瘤与周围正常脑组织。

　　Kircher等[12]将SPIO与荧光基团相耦联，从而合成了一种光学和MRI双功能探针，用以标记胶质瘤。然而该探针不仅标记胶质瘤细胞，而且还标记反应性星形细胞及巨噬细胞，使得该探针描绘的肿瘤范围大于实际的肿瘤范围。本实验使用Cltx修饰SPIO，从而合成了一种特异性的、高效性的胶质瘤靶向探针SPIOFC，该探针可特异性地标记胶质瘤细胞，但不标记其他细胞，真正实现了在细胞水平特异性标记胶质瘤。颅内胶质瘤被周围正常脑组织包围，本实验使用神经细胞作为胶质瘤细胞的对照，有效地模拟了这一组织学特点，实验结果提示：SPIOFC能有效地将胶质瘤与正常脑组织区分。以往的研究使用4.7 T 或 3.0 T MRI评价SPIO显像胶质瘤的能力[6，12]。本实验使用1.5 T MRI，MRI结果提示：以SPIOFC为探针，1.5 T MRI能有效地辨别胶质瘤与正常脑组织。这为SPIOFC在临床实践中的广泛应用创造了便利条件。然而，SPIOFC在体内的生物学分布、代谢动力学及靶向胶质瘤作用有待进一步研究。

　　总之，本实验结果证实：SPIOFC是一个特异性的、高效性的胶质瘤靶向探针;以SPIOFC为探针，MRI和光学成像能有效地辨别9L胶质瘤细胞与正常脑组织细胞。

　　致谢：本实验使用的胶质瘤细胞系由河本圭司教授 (日本关西医科大学神经外科) 提供，在此我们表示诚挚的谢意。

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