家兔上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎后SOD、MDA与脑含水量的变化

　　作者：唐忠　袁贤瑞　粟枫　姜维喜　罗端午　　作者单位：深圳市松岗人民医院神经外科， 广东 深圳 518105; 中南大学附属湘雅医院神经外科， 湖南 长沙 410008

　　【摘要】目的 探讨家兔上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎后窦旁皮质组织超氧化物歧化酶 (SOD) 活力、丙二醛 (MDA) 含量及脑含水量的变化及其意义。 方法 建立家兔上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎的动物模型，结扎后于不同时间点 (4 h、8 h、12 h、24 h、72 h、90 d) 测定窦旁皮质组织SOD活力与MDA的含量以及脑含水量。 结果 家兔上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎后，窦旁脑皮质组织MDA含量4 h开始明显上升，8 h达到峰值，12 h以后逐渐降低，但24 h仍然高于假手术对照组 (P <0.05)，90 d组基本接近对照组 (P >0.05)。SOD的活力变化与MDA含量变化相反;4 h窦旁皮质组织出现脑水肿，8 h到达高峰，以后随时间延长而逐渐减轻，90 d组脑水肿接近于假手术对照组。 结论 家兔上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎后在24 h内氧自由基反应增强，防御氧自由基功能受损，以后逐渐恢复正常;结扎后窦旁皮质组织早期存在脑水肿，可能与脂质过氧化有关。

　　【关键词】 兔　上矢状窦中1/3　超氧化物歧化酶　丙二醛　脑水肿

　　Changes in superoxide dismutase, malondialdehyde and brain water contents after ligation of the middle third of the superior sagittal sinus and its reflux veins in rabbits

　　TANG Zhong, YUAN Xianrui, SU Feng, et al

　　Department of Neurosurgery, Songgang Hospital, Shenzhen 518105, China; Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China

　　Abstract: Objective To explore the changes and significance in superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and brain water contents in the perisinus cortex after ligation of the middle third of the superior sagittal sinus and its reflux veins in rabbits. Methods The middle third of the superior sagittal sinus and its reflux veins was ligated in rabbits. The activity of SOD and MDA and water contents in the perisinus tissues were measured at 4, 8, 12, 24, 72 h and 90 d after the ligation. Results The MDA content in the perisinus cortex was increased significantly at 4 h after the ligation, reached the highest level at 8 h, decreased gradually 12 h later, but the content at 24 h was higher than that in the shamed operation group (P<0.05). The content of MDA at 90 d after the ligation was close to that of the shamed operation group (P>0.05). The change of SOD activity was opposed to the change of MDA content. The edema of the perisinus cortex occurred at 4 h, and increased significantly at 8 h, then decreased gradually with time, and the brain water content at 90 d was close to that of the shamed operation group. Conclusion There was an enhancement of oxygen free radical reaction and decrease of function against oxygen free radical injury within 24 hours after ligation of the middle third of the superior sagittal sinus and its reflux veins in rabbits, then they all restored to the normal level gradually. Brain edema formation at the early stage after the ligation is perhaps correlated with lipid peroxidation.

　　Key words: rabbits; middle third of the superior sagittal sinus; superoxide dismutase; malondialdehyde; brain edema

　　超氧化物歧化酶 (SOD) 是机体内自由基清除中的重要成分，对机体的氧化与抗氧化平衡起着关键的作用。SOD与丙二醛 (MDA) 的测定互相配合，可提示组织细胞受损害的程度。本研究通过建立家兔上矢状窦 (SSS) 中1/3及其回流静脉结扎 (SSS + RV) 的动物模型，检测并探讨其窦旁皮质组织SOD活力、MDA含量及脑含水量的变化及意义，探讨结扎后脑水肿的发生机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 家兔 (清洁级) 49只，雌雄不限，体质量1.5~2 kg，均购自中南大学动物中心。术前饲养20 d以适应环境。随机分为7组：假手术对照组 (SO组) 7只，仅开颅不进行SSS中1/3及其回流静脉结扎;SSS中1/3及其回流静脉结扎后分为4 h、8 h、12 h、24 h、72 h和90 d 6组，每组7只。

　　1.2 SSS中1/3及其回流静脉结扎动物模型的建立 参照Liebetrau等[1]的方法并加以改进[2]。

　　1.3 兔SSS中1/3窦旁脑皮质组织匀浆的制备 SO组家兔在开颅后4 h处死，余各组家兔在不同时间点断头处死。迅速取家兔SSS中1/3右侧窦旁中段靠后部皮质组织约200 mg，用0 ℃的生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干，称量，放入10 ml小烧杯中。用量筒量取预冷的匀浆介质：0.25 mol/L蔗糖、0.025 mol/L tris-盐酸、0.1 mmol/L EDTA二钠溶液10 ml。匀浆介质是组织块质量的9倍，用带刻度的滴管移取少量于烧杯中，尽量剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，剩余的匀浆介质冲洗残留在烧杯中的组织碎块后，一起倒入匀浆管中进行充分匀浆，研磨成10%组织匀浆。取少量匀浆组织进行涂片，显微镜下观察细胞直到细胞研破为止。匀浆组织以3 000 rpm/min离心15 min，取适量上清液进行测定。

　　1.4 兔SSS中1/3窦旁脑皮质组织匀浆MDA含量与SOD活力的测定 测定试剂盒由南京建成工程研究所提供。用硫代巴比妥酸 (TBA) 法测定兔SSS中1/3窦旁脑皮质组织匀浆MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。严格按照试剂盒说明书操作。721B型光栅分光光度计 (上海第三分析仪器厂) 在波长550 nm下比色测定SOD活力;在波长532 nm下比色测定MDA含量。

　　1.5 脑组织含水量测定 各组实验家兔于不同时间点用过量戊巴比妥钠处死，断头后迅速开颅取出脑组织，放在内置0.5 ml生理盐水湿润定性滤纸的培养皿中，以防水分蒸发，去除脑皮质表面的软脑膜，取SSS中1/3窦旁约0.2~0.3 g的脑皮质组织置于称量杯中称重 (从开始取脑至第1次称重完毕所用时间控制在5 min内)，放入电热恒温干燥箱内以105℃烤24h至恒重后称干重(2次干重之差≤0.2mg)，根据Elliott公式计算脑组织含水量。计算公式如下：脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重 × 100%。

　　1.6 结果分析 实验数据以均数 ± 标准差 (x ± s) 表示，并用SPSS10.0软件进行方差分析，P <0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 结扎后动物反应 SSS中1/3及其回流静脉结扎后4 h、8 h、12 h组各7只实验家兔精神差，反应迟钝。24 h组精神差6只，精神一般1只;进食一般6只，进食困难1只，均反应迟钝;四肢瘫4只，四肢轻瘫1只，偏瘫2只，肌张力均减低。72 h组结扎后第1天，精神差5只，精神一般2只;进食一般6只，进食困难1只，均反应迟钝;四肢瘫3只，四肢轻瘫1只，偏瘫3只，肌张力均减低;结扎后72 h，精神、进食情况以及反应均逐渐恢复正常，而神经症状也恢复正常。90 d组实验家兔3 d内反应与神经症状与72 h组相同，6只90 d后恢复正常，1只结扎后精神极差，进食困难，四肢瘫，于第4天死亡。

　　2.2 窦旁脑组织MDA含量 SO组的MDA含量为 (12.74 ± 1.58) nmol/mg;结扎后4 h、8 h、12 h、24 h组相比窦旁脑组织MDA含量明显高于SO组，差异具有统计学意义 (P <0.05);72 h、90 d组MDA含量与SO组之间差异无统计学意义 (P >0.05)，其中以90 d组MDA含量与SO组接近。说明MDA含量从4 h开始升高，8 h达到峰值，以后逐渐降低 。

　　2.3 窦旁脑组织SOD活力 SO组的SOD活力为 (472.24 ± 28.41) NU/mg;与结扎后4 h、8 h、12 h、24 h组相比窦旁脑组织SOD活力明显低于SO组，差异具有统计学意义 (P <0.05);72 h、90 d组SOD活力与SO组之间差异无统计学意义 (P >0.05)。说明SOD活力从4 h开始降低，8 h达到最低，以后逐渐升高 。

　　2.4 SSS中1/3窦旁脑皮质组织脑含水量改变 SO组脑含水量为 (77.90 ± 0.25)%;结扎后4 h、8 h、12 h、24 h组与SO组比较，脑含水量差异具有统计学意义 (P <0.05);72 h、90 d组与SO组之间差异无统计学意义 (P >0.05)。说明脑水肿从4 h开始，8 h达到高峰，以后脑水肿逐渐减轻，90 d时脑含水量已与SO组接近 。

　　3 讨论

　　本研究观察到家兔在SSS中1/3及其回流静脉结扎后可长期存活且大多数无死亡，本组仅死亡1只;SSS中1/3及其回流静脉结扎后能引起家兔精神差、反应迟钝，且可导致偏瘫、肌张力减低等神经学症状，但这些症状于结扎3 d后均逐渐恢复至正常。实验结果证实：家兔SSS中1/3及其回流静脉可以结扎，结扎后所引起的神经功能障碍可逐渐恢复，其原因可能与结扎后脑侧支循环开放，使静脉回流得以重新建立有关。

　　机体处于正常生理状态时，自由基在代谢过程中维持着动态平衡。体内自由基形成过多，多余的自由基会促成过氧化脂质的产生，而过氧化脂质的积累会损害细胞[3]。颅脑损伤时，大量释放的自由基可破坏细胞膜结构，导致脂质过氧化，MDA是脂质过氧化反应的终端产物，间接反映了体内过氧化反应的程度，因此测定SSS中1/3及其回流静脉结扎后不同时间点脑组织中MDA的含量，可以间接地了解脑组织脂质过氧化的变化过程。SOD属于自由基清除酶类，可以清除自由基、阻断脂质过氧化，保护细胞膜结构与功能的完整性。研究表明：自由基过量形成是对脑神经细胞损害的重要原因[4]。Lewen等[5]研究推论：SOD在小鼠处于缺血、缺氧环境下的脑保护作用中具有重要作用。SOD活力的高低间接地反映了机体清除氧自由基的能力[6]。

　　本实验结果提示：SSS中1/3及其回流静脉结扎后存在自由基反应增强，SOD活力降低，脑组织清除自由基的能力下降，防御氧自由基功能受损。我们的早期研究表明：SSS中1/3及其回流静脉结扎后早期脑神经细胞结构破坏[2]。由于细胞结构的破坏可以引起细胞内各种溶酶体的释放，在破坏细胞结构的同时产生了大量的自由基;回流静脉受阻致使脑供血不足，电子传递链断裂，产生并释放大量的自由基，同时出现MDA含量升高，而SOD活力降低。SSS中1/3及其回流静脉结扎后脑组织中MDA含量升高的可能原因：结扎后脑组织局部区域缺血、缺氧，而产生大量的MDA;局部脑损伤后释放出大量的Fe2+催化自由基反应，使MDA生成增加。

　　神经细胞和脑微血管内皮细胞既是氧自由基的产生部位，也是受损害最严重的部位。由于这些细胞均以脂质双分子层和多价不饱和脂肪酸为框架构成，因此，极易遭受氧自由基的攻击[7]。而氧自由基的攻击和细胞膜性结构的破坏致使细胞膜流动性和通透性增加，细胞溶酶体膜的破坏引起各种溶酶释放，导致细胞内环境紊乱，细胞肿胀，触发细胞毒性脑水肿。本研究证实：SSS中1/3及其回流静脉结扎后兔脑早期存在的脑水肿与自由基反应增强有关。SSS中1/3及其回流静脉结扎后引起脑水肿的机制：SSS中1/3及其回流静脉结扎，导致血栓形成，而血栓发展将影响静脉回流，加上回流静脉已被结扎，血液淤积，静脉压升高，在静水压的驱动下，游离水分经毛细血管床进入脑实质和脑室，脑脊液回流受阻，动脉血流减慢，脑组织缺血、缺氧，从而引起脑水肿。由于静水压增高后，侧支循环开放，使静脉回流得以重新建立，脑缺血、缺氧改善，脑水肿消退，细胞结构逐渐恢复。因此，窦旁皮质组织水肿随时间的延长而逐渐减轻，至90 d时，脑水肿趋于正常。

　　本实验结果显示：脑含水量的变化与MDA含量的变化一致，而与SOD活力变化相反。说明本实验出现的脑水肿与MDA含量密切相关。脑组织是以细胞为主构成的器官，富含脂质，因而对氧自由基所造成的损伤敏感。根据文献，我们认为SSS中1/3及其回流静脉结扎后脑水肿的起因，从另一个角度来说可能是结扎后脑缺血、缺氧导致能量供应受阻，酸性代谢产物的毒性作用，以及随之引起的SOD活力降低所导致的脂质过氧化。

　　【参考文献】

　　[1] LIEBETRAU M, GABRIEJCIC-GEIGER D, MEYER P, et al. Increased calpain expression following experimental cerebral venous thrombosis in rats [J]. Thromb Res, 2003, 112(4): 239-243.

　　[2] 唐忠, 袁贤瑞, 粟枫, 等. 家兔上矢状窦中1/3及其回流静脉结扎动物模型的建立 [J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2006, 11(3): 123-125.

　　[3] 周红伟, 章军建, 熊丽. 慢性脑缺血大鼠海马PARP、MDA的表达与阿魏酸钠的抗氧化作用 [J]. 中风与神经疾病杂志, 2005, 22(3): 213-215.

　　[4] 叶琳, 龚书明, 陈耀明, 等. 次声作用对大鼠大脑皮层脂质过氧化的影响 [J]. 中华物理医学与康复杂志, 2006, 24(6): 360-362.

　　[5] LEWEN A, MATZ P, CHAN P H. Free radical pathways in CNS injury [J]. J Neurotrauma, 2000, 17(10): 871-890.

　　[6] 董广宇, 陈建良, 禹婷婷, 等. 电针治疗对急性颅脑损伤后氧自由基反应的影响 [J]. 实用医学杂志, 2004, 20(6): 603- 605.

　　[7] MORO M A, ALMEIDA A, BOLANOS J P, et al. Mitochondrial respiratory chain and free radical generation in stroke [J]. Free Radic Biol Med, 2005, 39(10): 1291-1304.