胰岛素样生长因子2对局灶性脑缺血再灌注脑损伤的保护机制

　　作者：周铁柱 康志伟 张晓光 车玉琴 陈 雪1 胡晓颖1 作者单位：(中国医科大学第四医院神经内科，辽宁 沈阳 110032)

　　【摘要】 目的 探讨胰岛素样生长因子2 (InsulinLike Growth Factor2，IGF2)对局灶性脑缺血再灌注损伤影响的可能机制。方法 取55只SD大鼠建立局灶性脑缺血再灌注模型，随机分成假手术对照组(n=5)、脑缺血再灌注组(n=25)、IGF2治疗组(n=25)，按再灌注时间分为5个亚组，每个亚组5只(6 h组、12 h组、1 d组、3 d组、7 d组);脑缺血1 h后开始再灌注。免疫组化法检测脑缺血不同时间大脑皮层S100B蛋白，用原位末端标记技术和免疫组化分别检测各组大鼠大脑皮层缺血中心和周围区神经细胞凋亡和bcl2蛋白的表达。 结果 脑缺血再灌注损伤组与假手术对照组比较凋亡细胞数明显增多(P<0.05)，与脑缺血再灌注组相比，IGF2治疗组凋亡细胞数明显减少(P< 0.05);免疫组化检测结果显示，与脑缺血再灌注组相比，IGF2治疗组S100B蛋白表达明显减少(P< 0.05);与脑缺血再灌注组相比，IGF2治疗组bcl2蛋白表达明显增多(P< 0.05)。结论 IGF2可促进bcl2蛋白的表达增多，S100B蛋白表达减少，凋亡细胞数明显减少，可能是IGF2产生脑保护机制的原因之一。

　　【关键词】 胰岛素样生长因子2;S100B;bcl2蛋白;脑缺血再灌注脑损伤;凋亡;大脑皮层

　　近来研究发现，胰岛素样生长因子(IGF2)是一种重要的调节神经生长的物质，不仅是大脑发育所必需的，而且对脑缺血再灌注发挥重要的保护作用〔1〕，但该方面实验报道较少。S100B蛋白是神经胶质细胞分泌的蛋白质，反映神经细胞损伤水平，目前国内外尚无给予IGF2后脑缺血灌注区S100B蛋白的动态观察。为进一步探求IGF2对缺血性脑损伤的保护作用机制，本研究观察了局灶性脑缺血再灌注(I/R)后脑室内注射 IGF2对大鼠脑缺血区S100B蛋白表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康SD大鼠55只，雄性，体重250～290 g，中国医科大学实验动物中心提供。10%水合氯醛、SABC试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒、DAB显色剂(武汉博士德);IGF2(美国Sigma)、抗bcl2抗体、抗S100B抗体、尼龙线直径2.3 mm(日本伊东公司)，Olympus实体显微镜、计算机图像分析软件(Metamorph Imaging System)(中国医科大学实验技术中心)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型制备及分组 采用ZeaLonga〔2〕的大脑中动脉线栓法并加以改进，制备大鼠大脑中动脉局灶性脑I/R模型。大鼠用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，颈正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎ECA及CCA，在CCA分叉处剪一切口，将尼龙线栓子经CCA和ICA进入到大脑中动脉起始部，阻断右侧大脑中动脉，尼龙线栓子插入的深度距ICA和ECA分叉处为(19±0.5)mm，扎紧ICA处的备用线。假手术对照组除不插入栓子外,其余同实验组，术中、术后维持体温在37℃左右，缺血1 h后，拔出栓子2 mm，使血液再灌注，对各组大鼠以前囟后1.2 mm、中线旁1.5 mm为穿刺点，颅骨钻孔后，用微量注射器垂直进针3.5 mm,穿刺脑室，成功后假手术对照组及缺血组注入10 μl生理盐水，治疗组注入IGF2 10 μl (5 μg)。模型成功的标志为右侧Horner征，左侧出现以前肢为重的偏瘫。实验分为假手术对照组(n=5);I/R损伤组(n=25)，脑缺血1 h再灌注6、12 h、1、3、7 d处死(每个时间点5只);IGF2治疗组(n=25)，脑缺血1 h再灌注6、12 h、1、3 d、7 d处死(每个时间点5只)。

　　1.2.2 免疫组化染色检测bcl2蛋白和S100B蛋白的表达 各组大鼠至指定时间点处死后断头取脑，取前囟前后1 mm脑组织，常规固定、石蜡包埋、每隔100 μm连续冠状切片(厚6 μm)，进行免疫组化染色。胞浆有棕褐色颗粒者为阳性细胞。

　　1.2.3 TUNEL原位凋亡染色法检测细胞凋亡 按照原位TUNEL试剂盒说明书,常规处理切片,1∶1∶18混匀TDT、DIGdUTP和标记缓冲液的混合物，制成标记液标记,封闭液封闭，DAB室温显色20 min，苏木素轻度复染，0.1 mmol/L PBS洗涤，再经蒸馏水洗涤后，脱水、透明、树胶封片。结果判定：每个标本取2张切片，分别在高倍镜(400倍)下随机观察大脑皮层区缺血半暗带处不重叠的8个视野，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，计数凋亡细胞数。

　　1.3 统计学处理 每张切片中采集大脑皮质4个高倍视野，其中每个视野中细胞总数不少于100个。所测数据以x±s表示，组间比较采用SPSS13.0软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 bcl2蛋白表达 IGF2组较假手术对照组、脑I/R组bcl2蛋白表达明显增加(P<0.05)，脑I/R损伤组与假手术对照组相比，bcl2蛋白表达明显增加(P<0.05)，见表1、图1。

　　2.2 S100B蛋白表达 IGF2组较脑I/R损伤组S100B蛋白表达明显减少(P<0.05)，脑I/R损伤组与假手术对照组相比，S100B蛋白表达明显增加(P<0.05)，见表2、图2。

　　2.3 神经细胞凋亡情况 脑I/R损伤组与假手术对照组比较神经细胞凋亡明显增多(P<0.05)，IGF2组较I/R损伤组明显减少(P<0.05)，见表3、图3。表1 各组大鼠大脑皮层bcl2蛋白表与假手术对照组比较：1)P<0.05;与脑I/R组比较：2)P<0.05，下表同表2 各组大鼠大脑皮层S100B蛋白表达表3 各组大脑皮质内细胞凋亡数

　　3 讨 论

　　Beilharz等〔4～6〕实验证明，IGF2对实验性脑缺血具有神经保护作用,IGF2由67个氨基酸组成的多肽,通过IGF1受体起作用,生物学作用比IGF1弱,脑损伤后表达出现晚,由小胶质细胞分泌,聚集于正在分化的星形细胞周围,可能与脑损伤后胶质增生和损伤修复有关;IGF2直接作用于胆碱能神经纤维末梢，和IGF1相比，IGF2与IGF2受体有更高的亲和力〔4～6〕。

　　研究表明，bcl2基因位于18号染色体上，是重要的抗凋亡基因，其抗凋亡作用机制：①bcl2阻止促凋亡基因信号的传递，②bcl2抑制自由基发挥抗凋亡作用，③bcl2直接对抗各种脂质过氧化反应，④抑制线粒体释放促凋亡蛋白质，⑤bcl2过度表达直接或间接引起线粒体膜的超极化，以维持细胞内钙离子的稳态。缺血刺激bcl2的表达，绝大部分表达于缺血侧大脑半球、海马及纹状体处有缺血损伤而且尚存活的细胞〔7〕。

　　S100B蛋白是一组低分子量的钙结合蛋白，主要分布于中枢神经系统和周围神经系统的神经胶质细胞和Schwann细胞以及某些神经元细胞、黑色素细胞、软骨细胞和脂肪细胞中〔8〕。Persson对47名患有大脑梗死，瞬间局部缺血性发作，大脑内出血，蛛网膜下腔出血和头部损伤的患者进行了测试，在大面积梗死患者的脑脊液中发现S100B蛋白的浓度增加，在大脑梗死和瞬间局部缺血发作后的18 h～4 d，S100B的浓度持续增高，这些蛋白在脑脊液中的浓度升高也反映了患有大脑内出血、蛛网膜下腔出血或头部损伤等疾病的严重性,因此S100B蛋白浓度的变化可能反映脑部损伤的程度〔9〕。

　　本实验显示，侧脑室注射IGF2可以明显减少大脑皮层区凋亡细胞数和S100B蛋白表达，明显增加bcl2蛋白表达，说明IGF2能明显减少缺血再灌注损伤造成的神经细胞的凋亡，并上调bcl2蛋白表达，提示局灶性脑缺血时脑室内注射IGF2对神经元的保护作用可能与bcl2蛋白表达上调，减少凋亡细胞的产生，减少S100B蛋白表达有关。IGF2的脑保护作用目前尚处在动物实验阶段，不同给药途径、给药剂量、缺血时间、再灌注时间等因素都会对此产生影响〔10〕，因此，IGF2对脑缺血再灌注脑损伤的保护作用机制及治疗时间窗尚有待于进一步探讨。

　　【参考文献】

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