早期高压氧治疗对颅脑损伤神经细胞凋亡的影响

　　作者：刘勇，陈向林，朱玉辐，燕景峰，孔令胜，冯 军，胡小兵 作者单位：徐州医学院附属医院神经外科，江苏徐州

　　【摘要】 目的 通过研究早期高压氧治疗对大鼠颅脑损伤后相关基因Bcl-2、Bax表达影响,探讨其对损伤神经细胞的早期保护作用。方法 清洁级SD大鼠100只 ，随机分为正常组(Nor)20只、创伤组(TBI)40只、高压氧治疗组(HBOT)40只。采用Allen′s改良法建立大鼠自由落体脑损伤模型，在损伤6 h内予以高压氧治疗。伤后8 h及1、3、5、8天处死动物取材，苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化，流式细胞仪检测各观察点细胞凋亡率，免疫组织化学染色方法检测皮质及海马细胞中Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果 HBOT组各时点皮质及海马细胞均较TBI组形态规则、排列整齐，而且层次较多，胞核浓染、固缩的现象明显减少。与TBI组相比，HBOT组各时点的细胞凋亡率均显著下降(P<0.05)。HBOT组各时点Bcl-2表达强度均较TBI组增强(P<0.05，P<0.01),Bax表达强度均较TBI组显著降低(P<0.01)。结论 早期高压氧治疗能明显促进颅脑损伤后Bcl-2的高表达，抑制Bax的表达，能有效抑制颅脑损伤后细胞凋亡。

　　【关键词】 脑损伤;早期;高压氧;Bcl-2;Bax;细胞凋亡

　　The effect of early hyperbaric oxygenation treatment on the neurocyte

　　apoptosis following craniocerebral injury

　　LIU Yong， CHEN Xianglin, ZHU Yufu, YAN Jingfeng, KONG Lingsheng, FENG Jun, HU Xiaobing

　　(Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To investigate the effects of early hyperbaric oxygenation treatment (HBOT) on the expression of apoptosis genes Bcl-2 and Bax following the rat brain injury and study the neuronal protecting mechanism. Methods 100 Sprague-Dawley rats were divided into 3 groups: Normal group (20 rats), TBI group (40 rats), HBOT group (40 rats). Based upon the Feeney′s model of modified Allen′s method, experimental animals were treated with HBO within 6 hours. The animals were sacrificed at the 8th hour, and on days 1, 3, 5 and 8, respectively. Their hippocampus cells were observed for morphological changes by H-E staining; the apoptosis rate of injured hippocampus cortex was detected by flow cytometry; and the expression of protein Bcl-2 and Bax was detected with immunohistochemical staining. Results H-E staining indicated that, in contrast to TBI group, in HBOT group the hippocampus cortex and the hippocampus cells at appropriate times had regular morphology, orderly arrangement and more stratal distributions, with a significant reduction in nuclear dense-staining and pyknosis, and marked decrease in apoptosis rate of hippocampus cells (P<0.05 or P<0.01); increased expression of Bcl-2 in HBOT group (P<0.05) and significantly decreased expression of Bax (P<0.01). Conclusion The early HBOT can promote Bcl-2 expression and inhibit Bax expression, which is effective in inhibiting apoptosis rate following craniocerebral injury.

　　Key words: brain injury; early stage; hyperbaric oxygenation; Bcl-2; Bax; apoptosis

　　1955年美国学者Rink等[1]首先证实颅脑损伤后神经细胞存在着凋亡现象以来，许多学者研究表明：在颅脑损伤早期，脑损伤的机械性创伤破坏脑组织造成局部出血和缺血，通过各种诱因调控诱导半暗带区脑细胞的凋亡。Conti等[2]的大鼠脑损伤实验结果显示：急性期和延迟性神经细胞死亡均与细胞凋亡有关，脑损伤后12 h即出现细胞凋亡。本研究通过制作大鼠自由落体脑损伤模型，予以早期高压氧处理，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,运用免疫组化方法对颅脑损伤后应激期指标及凋亡相关基因Bcl-2、Bax进行定性、定量研究，探讨高压氧在颅脑损伤早期保护神经细胞的分子机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物分组及处理 雄性SD大鼠100只，体重(300±20)g，由徐州医学院实验动物中心提供，随机分成正常组(Nor组)20只、创伤组(TBI组)40只、高压氧治疗组(HBOT组)40只。Nor组：不作任何处理。HBOT组：致中等程度脑损伤，颅脑损伤后6 h内行第1次高压氧治疗，以后每天1次。 TBI组：处理步骤同HBOT组，不同之处是高压氧舱加压后木箱内不充氧气，而是给予压缩空气。HBOT组分别于致伤后8 h及1、3、5、8天进行高压氧治疗后，Nor组、TBI组于相对应时间点，处死大鼠取标本进行苏木精-伊红染色观察,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白表达。

　　1.2 大鼠颅脑损伤模型制作 动物称重麻醉后，头顶部备皮，碘伏局部消毒。沿右侧顶部切开头皮约1.5 cm，钻开骨窗，直径约5 mm，保持硬脑膜完整。采用Allen′s改良法[3]致伤造成右颞顶叶的脑挫裂伤，用骨蜡封闭骨窗，缝合切口。动物无死亡，左侧轻度偏瘫。

　　1.3 高压氧治疗 HBOT 组大鼠致伤6 h内，使用Y-C14+4型改良动物实验舱进行高压氧治疗。治疗过程为：将动物置于80 cm×45 cm×40 cm的特制木箱(连接给氧装置)内，木箱置于国产双舱四门式加压舱内，随即用压缩空气加压，升压时间20 min,升压10 min时开始向木箱内充氧气(纯氧供给，高压氧操作系统控制充氧过程)，压力升至200 kPa后稳压，在该压力下继续持续充氧30 min，停止充氧10 min，之后再次向木箱内充氧30 min，然后等速减压20 min，出舱。开始升压时，大鼠活跃，随即安静，给氧约40 min后大鼠又表现活跃和兴奋，无抽搐和死亡。舱内温度18～24℃。

　　1.4 组织病理学检查 于规定的不同时间点，在深麻醉下开胸，暴露心脏，先快速(约10 min)灌注生理盐水约150 ml，冲净血液，再以4℃10%多聚甲醛液350 ml灌注，完毕即开颅取脑，立即置于4℃10%多聚甲醛液中后固定6 h, 以脑挫伤组织为中心做冠状3.5 mm厚切片，常规脱水、石蜡包埋，片厚5 μm连续冠状切片3～4套，贴于备好的载玻片上，放于烘干机上烤12 h，分别进行苏木精-伊红染色、免疫组化染色，镜下观察皮质及CA1、CA3区细胞和灰度值。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞调亡率 于规定的不同时间点麻醉后快速断头，于冰上取脑挫伤皮质组织，研磨均匀，制备单细胞悬液。取制备好的单细胞悬液0.5 ml，加入乙醇至终浓度为70%，于4℃固定45 min，1 000 r/min离心10 min，去上清，加入1 g/L的RNAse 0.2 ml，37℃孵育30 min， 4℃避光保存30 min后上机检测。在DNA组方图上，G1峰前出现一个亚G0峰，分析该峰所占的百分比即可得出凋亡细胞的百分比。

　　1.6 统计学处理 所有数据用Microsoft Excel及SPSS统计软件进行数据处理，结果以±s表示，选用两因素方差分析检验不同组及各时点间差异，用单因素方差及两两比较分析同一时间点各组间的差异，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大体观察 TBI、HBOT组绝大多数大鼠脑膜血管充血，蛛网膜下腔局部或弥漫性出血。

　　2.2 苏木精-伊红染色光镜观察 Nor组：大鼠皮质细胞边界清楚，胞核呈蓝色，细胞质及其他组织呈粉红色，部分细胞可见核仁。CA1区细胞排列密集;CA3区细胞排列较松散，但细胞层次较多、胞体较CA1区稍大。TBI组：细胞大小不均，胞核深染，细胞排列松散，间隙扩大;伤后8 h即有部分细胞胞体溶解，胞质淡染，胞核固缩，残存的细胞界限不清;随伤后时间推移，上述变化更加明显。HBOT组：伤后8 h开始，细胞形态没有明显变化;24 h时，锥体细胞略增大，少数细胞缩小，亦有核深染及胞质淡染现象，排列较密集;3天时部分细胞缩小，间隙变大，有胞核固缩现象;5天时部分细胞胞体溶解及胞核浓缩;8天时残存的细胞排列尚齐整，完整细胞数量较TBI组明显增多。

　　2.3 Bcl-2免疫组化检查 Nor组：大鼠Bcl-2在皮质及海马CA1、CA3区均有表达，在高倍镜下，表达Bcl-2蛋白的神经细胞核形态正常，很少见到凋亡或坏死的形态特征。TBI组：大鼠伤后8 h，伤侧皮质、海马CA3区Bcl-2表达强度即有下降(P<0.01);伤后1天，伤侧皮质、海马CA3区Bcl-2表达强度显著下降，灰度值水平较正常组降低(P<0.01);3天时表达强度较正常组仍低(P<0.05);5、8天时灰度值较前明显上升，但仍较正常组低(P<0.05)。HBOT组：伤后经高压氧治疗，8 h时伤侧皮质、海马CA3区Bcl-2灰度值水平较TBI组明显升高(P<0.05);1天时较TBI组高(P<0.01)，着色较深，颗粒分布较密集(图1);3天时表达最高(P<0.01);5、8天时虽略低于正常组，但仍高于TBI组(P<0.05)。见表1、2。表1 皮质Bcl-2灰度值水平 表2 海马CA3区 Bcl-2灰度值水平与Nor组比较：**P<0.01;与TBI组比较：#P<0.05，##P<0.01

　　2.4 Bax 免疫组化检查 Nor组：皮质、海马组织Bax有少量表达，可见突起着色。TBI组：伤后8 h开始，伤侧皮质、海马CA3区Bax免疫反应强度较前明显增强,3天时反应最强烈,明显高于Nor组(P<0.01);随后开始下降，至5、8天时表达强度明显下降，但仍然明显高于Nor组(P<0.05)。HBOT组：早期治疗后8 h开始，各时点Bax表达强度均较TBI组显著降低(P<0.01)，颗粒着色淡，分布稀疏(图2);除3、5天Bax灰度值较Nor组较高外，伤后8 h、1天、8天时其Bax灰度值接近Nor 组水平。见表3。表3 海马CA3区Bax灰度值水平与Nor组比较：**P<0.01;与TBI组比较：##P<0.01

　　2.5 皮质细胞凋亡率 HBOT组各时点的细胞凋亡率均较TBI明显降低(P<0.05)。3组细胞凋亡率见表4。表4 3组大鼠皮质凋亡率比较与Nor组比较：**P<0.01;与TBI组比较：#P<0.05

　　3 讨 论

　　高压氧治疗颅脑损伤临床应用已有大量报道，但在颅脑损伤早期治疗中保护脑神经细胞的机制仍不明确。有些学者已从基因、分子水平来观察和认识脑损伤机制，提出了“损伤级联反应”的概念[3] 。目前公认与细胞凋亡有关的基因是Bcl和Bax。Bcl-2通过阻断活性氧自由基的形成来防止细胞凋亡。Bcl-2蛋白的作用与一种相对分子质量为21×103的Bax蛋白有关，Bax可以抵消Bcl-2的抑制凋亡作用。因而，Bax与Bcl-2在细胞内的表达比率是决定细胞在体内受到某种刺激之后是否会发生凋亡的一个重要因素[4] 。

　　研究证明，Bcl-2、Bax 基因编码的蛋白在调节细胞凋亡过程中起着重要作用。Bc1-2过表达可封闭凋亡，促进细胞存活，而Bax增加，可促细胞凋亡[5-6]。凋亡调控基因Bcl-2被称为“长寿基因”，能够延长细胞的寿命;Bax则促进细胞死亡，它常表达于易凋亡的细胞内，且具有直接促凋亡作用。本实验中观察了高压氧作用下大脑损伤后脑皮质、海马区神经元Bc1-2和Bax蛋白表达的变化情况，结果提示高压氧治疗有效促进大脑损伤后Bc1-2的表达、抑制Bax的表达。骆纯等[7]亦报道，Bcl-2 mRNA的早期改变出现在伤后6 h，早于细胞凋亡的发生，伤后3天达低谷，以后逐渐恢复;伤后3～7天逐渐下降。并且，动物经用抗氧化剂后能大大降低Bcl-2蛋白表达的水平[8]。

　　高压氧治疗脑损伤的机制主要体现在以下两个方面：其一，改善损伤脑组织的供血、供氧，阻断缺氧-水肿-缺氧的恶性循环;其二，减轻脑损伤后细胞凋亡，研究证实，细胞凋亡是脑损伤后神经细胞死亡的一种方式。本实验中苏木精-伊红染色显示高压氧治疗组细胞浓染、固缩的现象出现较晚，存活细胞明显增多，细胞排列较规整;流式细胞检测结果表明，高压氧能有效降低TBI后细胞凋亡。

　　高压氧治疗可改善脑损伤急性期病理变化，打破其恶性循环而对各种原因引起的脑损伤均具有确切的疗效，并已得到公认。本实验表明早期高压氧治疗能显著影响Bcl-2、Bax表达，有效抑制颅脑损伤后细胞凋亡率，提示Bcl-2、Bax在颅脑损伤后细胞凋亡中参与并发挥了重要的作用。但引起细胞凋亡的因素较多，关于颅脑损伤后细胞凋亡的机制还有待于深入研究。

　　【参考文献】

　　[1] Rink A, Fung KM, Trojanowski JQ, et al. Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat [J]. Am J Pathol, 1995,147(6):1575-1583.

　　[2] Conti AC, Raghupathi R, Trojanowski JQ, et al. Experimental brain injury induces regionally distinct apoptosis during the acute and delayed post-traumatic period [J].J Neurosci,1998,18(15):5663-5672.

　　[3] Jarskog LF， Gilmore JH. Developmental expression of Bcl-2 protein in human cortex [J]. Brain Res Dev Bain Res, 2000, 119(2)：225-230.

　　[4] Xu L, Lee JE, Giffard RG. Overexpression of bcl-2, bcl-XL or hsp70 in murine cortical astrocytes reduces injury of co-cultured neurons [J]. Neurosci Lett, 1999,277(3):193-197.

　　[5] 周永炜，俞丽华. 高压氧对脑血管疾病的治疗进展[J].国外医学·脑血管疾病分册，1995，3(2)：90-94.

　　[6] 戈 平，姜 毅. 中枢神经系统氧中毒[J].新生儿科杂志，1998，13(6)：279-282.

　　[7] 骆 纯，朱 诚，江基尧,等. 大鼠脑创伤后bcl-XL 和bax mRNA的表达改变[J].中华创伤杂志，2001,17(4):209-211.

　　[8] Xiong Y, Lin H, Chen BD, et al. Appearance of shortened Bcl-2 and Bax proteins and lack of evidence for apoptosis in rat forebrain after severe experimental traumatic brain injury [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001,286(2):401-405.