糖尿病大鼠逼尿肌线粒体超微结构及基质的改变

　　作者：双卫兵,王东文,张炜芳,吴博威　　作者单位：

　　An experimental study of ultrastructural change of mitochondrion of detrusor in diabetes rats　Shuang Weibing, Wang Dongwen, Zhang Weifang, Wu Bowei　(Department of Urology, First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

　　ABSTRACT: Objective To observe the ultrastructural changes of detrusor in experimental T2DM rats. Methods 14 Wistar rats were divided into two groups. The T2DM group rats underwent intraperitoneal inject with 30mg/kg streptozotocin (STZ) 3 times, once a day. Then these rats were fed with the diets enriched with sucrose (20%, w/w), lard (18%, w/w) and yolk powder (3%, w/w) 2 weeks after they had been injected. Another group served as controls. The ultrastructures of mitochondrion in detrusor cells of each rats were examined after 12 weeks. Results The relative density of mitochondrion was 0.836±0.279 in T2DM group while 0.572±0.083 in the controls(P<0.05). Conclusion Detrusor contraction of the bladder is impaired in the early stage of diabetes, the mitochondrion destroyed, and the detrusor metabolism dysfunction should been one of the causes.

　　KEY WORDS: bladder; mitochondrion; diabetes; detrusor

　　摘要：目的 观察2型糖尿病(T2DM)大鼠逼尿肌细胞线粒体超微结构的改变。方法 建立T2DM大鼠动物模型,利用透射电镜观察其逼尿肌细胞内线粒体结构并应用BI2000序列图像分析软件检测线粒体密度。结果 对照组的线粒体相对光密度为2.417±0.376,相对灰度为0.572±0.083;T2DM组逼尿肌细胞内线粒体相对光密度为1.549±0.871,相对灰度为0.836±0.279，线粒体基质密度较正常明显下降。结论 糖尿病大鼠逼尿肌细胞内线粒体超微结构破坏,基质密度下降,提示逼尿肌细胞能量代谢障碍是糖尿病膀胱收缩力降低的原因。

　　关键词：膀胱;线粒体;糖尿病;逼尿肌

　　糖尿病引起膀胱功能障碍最常见的症状是膀胱感觉功能障碍，残余尿增多，排尿期逼尿肌收缩力减弱[1]，尤其在晚期更为明显，严重影响患者的生活质量。而糖尿病膀胱尿道功能障碍的具体发病机制目前还不清楚。近期研究表明上述的功能变化存在着神经性、血管源性和肌源性的因素，肌源性因素正日益受到人们的重视。我们建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型,在了解逼尿肌功能变化的基础上,进一步观察逼尿肌细胞线粒体超微结构的变化，以探讨其功能变化的细胞生物学基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 T2DM大鼠模型的建立[2]及实验分组

　　清洁级近交系4周龄雌性Wistar大鼠(山西医科大学动物中心提供)，体质量180-190g，随机分为T2DM组和对照组。链脲佐菌素(strepozotocin, STZ)溶于pH4.4，浓度为0.1mol/L枸橼酸缓冲液中，T2DM组大鼠按30mg/kg体质量的剂量腹腔内注射STZ，每日1次，连续3次;在末次注射2周后,改喂高糖高脂饮食(18%猪油，20%蔗糖，3%蛋黄，59%普通饲料)。高糖高脂饮食喂养第3周测定血糖及胰岛素，挑选空腹血糖大于对照正常大鼠空腹血糖均值+3个标准差，胰岛素敏感性降低者确定为T2DM大鼠纳入实验。对照组给普通饲料，腹腔内注射等体积的枸橼酸缓冲液。实验第14周分别取T2DM组及对照组动物各9只，制备逼尿肌标本进行电镜观测。

　　1.2 标本制备

　　处死大鼠后立即切取膀胱，取膀胱体部逼尿肌组织，去除黏膜层及浆膜层，将逼尿肌组织切成1mm3小块，加预冷的2.5%戊二醛-2%的多聚甲醛混合固定液2mL，于4℃下固定2h，再用磷酸缓冲液冲洗后，用1%锇酸固定1.5h，逐级脱水，再用70%酒精饱和醋酸铀块染8-10h，用环氧树脂618包埋，于60℃下聚合48h，用瑞典LKB型超薄切片机制成厚约50nm的切片，置于铜制切片载网上干燥保存。

　　1.3 线粒体结构观察和灰度测定

　　应用JEM100CX型透射电子显微镜,放大15×103倍观察线粒体。每只实验鼠选取逼尿肌为纵行走向、靠近逼尿肌细胞核的6个视野摄片，图片用BI2000序列图像分析软件测定每个视野中线粒体的平均光密度和平均灰度。为避免各个视野在成像时由于曝光时间不同造成的密度差别,同时在线粒体周围圈取细胞胞质测定胞质平均光密度和平均灰度。将线粒体平均光密度与周围胞质的平均光密度的比值定义为该线粒体相对光密度,将线粒体平均灰度与周围胞质的平均灰度之比值定义为该线粒体相对灰度[3]。

　　1.4 统计学处理

　　分别计算T2DM组和对照组逼尿肌线粒体相对光密度和相对灰度值的均数和标准差,应用SPSS11.0统计软件进行t检验，α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 两组间线粒体形态的比较

　　T2DM组逼尿肌细胞中线粒体呈现不同程度的肿胀，基质密度降低，线粒体嵴断裂、变短、稀疏、消失，部分线粒体甚至可呈空泡状(图1A)。对照组线粒体基质致密，线粒体嵴清晰，完整(图1B)。

　　2.2 两组间线粒体基质相对光密度及相对灰度的比较

　　图像分析软件将灰度最高值定义为0,灰度最低值定义为255。线粒体相对光密度和相对灰度均可反映线粒体基质的密度情况，而线粒体基质密度减低程度可以作为线粒体肿胀的定量指标。与对照组相比，T2DM组线粒体基质平均相对光密度显著降低，而平均相对灰度显著增高(P<0.05，表1)。表1 两组线粒体基质图象分析结果(略)

　　3 讨 论

　　在临床尿动力学检查中我们发现糖尿病病人逼尿肌收缩力减弱或无反射较为常见，表现为尿流率低，残余尿增多，WF(瓦特因子)降低。熊恩庆[4]等在动物实验中也发现糖尿病早期就有逼尿肌收缩功能受损，表现为逼尿肌最大收缩力和持续收缩力下降。我们应用机械性牵张刺激试验也观测到，糖尿病发病的最初阶段就出现了逼尿肌兴奋性和自律性的改变，表现为诱发逼尿肌收缩的最小牵张力增高，逼尿肌兴奋性降低，自律性随着发病时间的延长表现为先增高后降低[2]。

　　线粒体是各类真核细胞中广泛存在的一种细胞器，主要功能是进行氧化磷酸化。线粒体通过氧化磷酸化合成ATP，为细胞的生命活动提供能量，是细胞能量来源的主要途径。线粒体对外界的影响极为敏感,线粒体损害可能是细胞不可逆损害的最可靠的早期表现之一,是细胞病变最敏感的指标之一,是分子细胞病理学检查的重要依据。本研究观察到糖尿病大鼠膀胱逼尿肌细胞中线粒体呈现不同程度的肿胀,基质密度下降,线粒体嵴稀疏、变短、断裂甚至消失，部分线粒体转化为空泡状结构;而对照组线粒体基质致密，线粒体嵴结构清晰完整。这种超微结构的改变与临床尿动力学的变化特征相一致。可见线粒体的形态改变与逼尿肌细胞功能变化密切相关。

　　线粒体基质密度的变化可以反映线粒体变化情况。线粒体发生肿胀时基质密度呈现减低趋势。相对光密度与线粒体基质密度呈正相关，即相对光密度增高反映了线粒体基质密度增高;而相对灰度与密度呈负相关，即相对灰度增高是线粒体基质密度降低的表现。我们应用这一原理，运用图像分析软件进行定量测定，证实糖尿病大鼠线粒体基质密度降低。

　　我们在另外的研究中已经检测到T2DM大鼠逼尿肌细胞线粒体中某些三羧酸循环的关键酶(限速酶)活性显著下降(另文刊出),可见在糖尿病神经源性膀胱的发病过程中直接影响到了膀胱逼尿肌细胞的能量代谢。线粒体破坏导致的逼尿肌能量代谢障碍是引起逼尿肌收缩功能障碍的主要病理学基础。

　　参考文献：

　　[1]王东文，双卫兵，吴博威. 糖尿病患者膀胱功能改变的临床研究 [J]. 临床泌尿外科杂志, 2004, 19(11):646648.

　　[2]双卫兵，王东文，张旭. 非胰岛素依赖型糖尿病大鼠膀胱兴奋性、自律性改变的实验研究 [J]. 现代泌尿外科杂志, 2005,10(1):57.

　　[3]王杭，王国民,钟慈声. 雄性兔膀胱出口部分梗阻所致逼尿肌超微结构的改变 [J]. 中华泌尿外科杂志, 2003,24(1):5254.

　　[4]熊恩庆，龚宇，宋波，等. 糖尿病大鼠膀胱舒张及收缩功能实验研究 [J]. 第三军医大学学报, 2000,22(8):744746.