脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态研究

　　作者：裴傲 张亚卓 万伟庆 孙梅珍 王红云 何 乐 作者单位：首都医科大学附属北京市神经外科研究所， 北京 100050

　　【摘要】 目的　 探讨脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态，及其在肿瘤发生中的作用。 方法　 采用甲基化特异性PCR (MSP) 方法，检测42例脑胶质瘤hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态。 结果　 hMLH1启动子区甲基化2例 (4.8%)，hMSH2启动子区甲基化13例 (31.0%)，启动子区甲基化与性别、年龄、病理类型和病理分级无明显的相关性。 结论　 hMSH2基因启动子的CpG岛在脑胶质瘤中有高甲基化现象，可能与胶质瘤的发生有关，而hMLH1基因启动子区甲基化少见。

　　【关键词】 神经胶质瘤 碱基错配 DNA修复 启动区 (遗传学) 甲基化

　　Methylation status of promoter of mismatch repair gene hMLH1 and hMSH2 in glioma

　　PEI Ao, ZHANG Yazhuo, WAN Weiqing, et al

　　Beijing Neurosurgical Institute, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China

　　Abstract: Objective To explore the methylation status of hMLH1and hMSH2 promoter region in glioma and its role in the oncogenesis. Methods Methylation status of the hMLH1and hMSH2 promoter region was assayed in 42 glioma tissues by methylation-specific PCR (MSP). Results Methylation in the hMLH1 and hMSH2 promoter regions was found in 2 cases (4.8%) and 13 (31.0%) respectively. Methylation status in the promoter region showed no obvious correlation with the sex, age, pathological type and grade. Conclusion hMSH2 promoter (CpG island) hypermethylation exists in glioma, which may correlates with the occurrence of glioma. However, methylation status of hMLH1 promoter is rare in glioma.

　　Key words:　 glioma; base pair mismatch; DNA repair; promoter regions (genetics); methylation DNA错配修复 (DNA Mismatch Repair，MMR)系统能够特异性识别、切除并修复错配碱基，以保证DNA复制的忠实性，保持遗传物质的稳定性和完整性，避免发生基因突变[1]。hMLH1和hMSH2是重要的MMR基因，其启动子甲基化可导致基因表达异常，影响错配修复功能，不能纠正相关基因的突变，从而导致肿瘤发生。本研究对42例脑胶质瘤标本中hMLH1和hMSH2启动子区的甲基化状态进行检测，以探讨其在脑胶质瘤发生中的作用，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 男20例，女22例;年龄3～71岁，平均37.6岁。术前均未行放疗或化疗。按WHO中枢神经系统肿瘤分类标准，星形细胞瘤11例，少枝胶质细胞瘤4例，少枝-星形细胞瘤12例，室管膜瘤5例，胶质母细胞瘤10例;Ⅰ～Ⅱ级25例，Ⅲ～Ⅳ级17例。正常脑组织标本5例，取自同期脑外伤、脑皮质造瘘病例。标本切除后30 min内分块置于液氮内冷冻储存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 提取DNA： 用组织DNA提取试剂盒 (EZNA Tissue DNA Kit，Omega公司) 从冷冻标本中提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，紫外分光光度仪检测吸光度，计算DNA含量及纯度。

　　1.2.2 甲基化特异性PCR (methylation specific PCR，MSP)： ①DNA的亚硫酸氢盐修饰：取基因组DNA 10 μl (浓度约100~200 ng/μl)，使用DNA CpG岛甲基化修饰试剂盒 (CpGenome DNA Modification Kit，Chemicom公司，S7820)，按说明书对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。②PCR扩增：引物序列由北京奥科生物有限公司合成 (表1)。PCR反应体系为20 μl，以无菌蒸馏水代替DNA模板作阴性对照。PCR反应混合物包括：10 × PCR缓冲液2 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，25 mmol/L MgCl2 2.8 μl，上、下游引物 (10 μmol/L) 各1 μl，DMSO 1 μl，DNA模板2 μl，无菌蒸馏水7.2 μl，加石蜡油2滴。PCR反应过程：95 ℃预变性5 min，加入Taq酶 (1 u/μl) 1 μl;95 ℃ 30 s，退火温度30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，采用紫外光凝胶成像系统观察结果。③结果分析：若基因启动子发生甲基化，用甲基化特异性引物扩增可出现相应大小的条带;若未发生甲基化，用非甲基化特异性引物扩增可出现相应大小的条带。实验结果采用χ2检验，SPSS10.0统计软件进行分析。

　　2 结 果

　　本组hMLH1启动子区甲基化2例 (4.8%)，hMSH2启动子区甲基化13例 (31.0%);均为甲基化与非甲基化状态并存，即部分甲基化 (图1，2)。甲基化与性别、年龄、病理类型和分级无明显的相关性(表2)。正常脑组织中未发现hMLH1和hMSH2启动子区甲基化。

　　3 讨 论

　　错配修复系统功能缺陷细胞的突变率是正常细胞的100～1 000倍[2]，而且大多数伴有微卫星不稳定 (Microsatillite instability，MSI) 现象。因此，MMR系统与肿瘤的发生、发展密切相关。人类的MMR基因主要有hMSH2、hMSH6、hMSH3、hMLH1、hPMS1等，其中对hMSH2和hMLH1的检测研究最多。最早发现遗传性非息肉性结肠癌的发生与多种错配修复基因的突变有关联[3]。在散发性大肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、子宫内膜癌及白血病等肿瘤中，均存在MMR系统的异常。但在多种散发性肿瘤中，多种错配修复基因的突变并不多见，错配修复的功能缺陷主要由基因启动子区CpG岛的甲基化引起[4]，其中以hMLH1基因的启动子区甲基化最常见。由于启动子区内某些CpG岛对转录起始点具有调控作用，其甲基化可使hMLH1基因不能转录而导致基因不能正常表达[5，6]。目前对hMSH2基因失活与启动子区甲基化相关性的报道尚少，张翠娟等[7]报道在38例肝细胞癌中，26例 (68.4%) 发生了hMSH2启动子区甲基化，6株肝癌细胞系中5株发生了hMSH2启动子区甲基化;认为hMSH2基因甲基化与mRNA表达密切相关。

　　在脑肿瘤与错配修复基因的研究中，Wei等[8]报道在33例脑胶质瘤中，7例 (21.2%) hMLH1 mRNA表达水平降低，14例 (42.4%) hMSH2 mRNA表达水平降低。林瑜等[9]对37例脑胶质瘤进行了MSI和hMLH1、hMSH2蛋白表达的检测，其中10例hMLH1或hMSH2蛋白表达异常，且均为MSI阳性。以上结果均提示：脑胶质瘤的发生与DNA错配修复功能缺陷有关。

　　本研究采用MSP法检测hMLH1启动子区-721至-598bp片断内7个CpG位点，及hMSH2启动子区-110~ + 33bp片断内7个CpG位点的甲基化状态。在正常脑组织中均未发现CpG位点甲基化。在42例脑胶质瘤标本中，hMLH1启动子区甲基化率仅4.8%，而hMSH2启动子区的甲基化率为31.0%。故hMLH1启动子区甲基化在脑胶质瘤并非常见，与胶质瘤的发生无明显关联;hMSH2启动子区甲基化在脑胶质瘤中有中等程度的表达，与病理类型和分级无关，说明hMSH2启动子区甲基化可能与脑胶质瘤的发生有关，是脑胶质瘤发生过程中的早期分子事件，可望成为脑胶质瘤早期诊断的指标之一。

　　【参考文献】

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　　[7] 张翠娟, 李晓明, 丘礼武, 等. DNA错配修复基因甲基化在肝细胞癌发生发展中的作用 [J]. 中华病理学杂志, 2004; 33(5): 433-436.

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　　[9] 林瑜, 杨树源, 周阅昌, 等. 脑肿瘤微卫星不稳定性和错配修复基因hMLH1、hMSH2蛋白表达的改变 [J]. 中华神经外科杂志, 2000; 16(6): 348-352.