原浆型星形胶质细胞调控神经干细胞定向分化的优化比例筛选

　　作者：李民，曾琳，刘媛，龙在云，李书林，伍亚民

　　【摘要】 目的 将神经干细胞(NSC)与原浆型星形胶质细胞(PAS)以不同比例进行体外共培养，观察NSC的定向分化的差异，筛选出有利于向神经元分化的最佳方案，为体内实验提供依据。方法 根据NSC与PAS的比例进行分组：3:1组;2:1组;1:1组;1:2组，共培养10天后，采用免疫组化法对分化神经元进行DAPI荧光标记，在显微镜下随机选取20个视野，每次计数100个细胞，计算神经元在NSC中所占的比例，并进行统计学处理。结果 NSC：PAS 2：1组分化得到的神经元数量最多，与分化的胶质细胞比例为65%:35%;而1：1组、3：1组稍低一些，比例分别为61%:39%和59%:41%;1:2组比例最低为57%:43%。结论 在离体细胞共培养的实验中，因细胞的比例不同，NSC分化亦存在差异，其中NSC:PAS为2:1时，NSC分化为神经元的比例最高。

　　【关键词】 星形胶质细胞;神经干细胞;分化;比例

　　A selection of optimized ratio of the protoplasmic and fibrous astrocytes to the directional differentiation of neural stem cell

　　LI Min,ZEGN Lin,LIU Yuan,et al.

　　(State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Department 3,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)

　　Abstract: Objective Through culturing NSC with PAS in various ratios，we try to find the best ratio in which maximum amounts of neurons can differentiate from NSC.Methods By coculturing of NSC with PAS in the ratio of 3:1 or 2:1 or 1:1 or 1:2 for 10 days, immunohistochemisty with DAPI was taken to calculate the proportion of neurons within 100 cells in 20 fields of vision chosen randomly.The data were analyzed statistically.Results The percentage of neurons differentiated from NSC in the ratio of 2:1(65%) was much more than that in the other groups.The groups of 1:1 and 3:1(61% and 59%) were lower than the group of 2:1,the group of 1:2(57%) was the lowest group.Conclusion In vitro coculture of NSC and PAS in a ratio of 2:1 may be more advantageous for NSC in differentiating into neurons.

　　Key words:astrocyte;neural stem cell;differentiation;ratio

　　本室在实验中观察到原浆型星型胶质细胞(protoplasmic astrocyte，PAS)与纤维型星型胶质细胞(fibrous astrocyte，FAS)相比更有利于神经干细胞(neural stem cell，NSC)向神经元的分化[1]。但不同比例条件下NSC向神经元分化的情况可能存在差异，为此本实验将NSC与PAS以不同比例进行体外共培养，观察NSC的定向分化的差异，筛选出有利于向神经元分化的最佳方案，为体内实验提供依据。

　　材料与方法

　　1 实验动物

　　孕13～14天的大鼠和新生2天的大鼠。

　　2 试剂与材料

　　10%胎牛血清(FBS，Hyclone)，2mmol/L L谷氨酰胺(Sigma)，0.6%葡萄糖，DMEM/F12培养基(Hyclone)，多聚赖氨酸，0.25%胰蛋白酶 (Sigma)，10mmol/L Lleucinemethylester(Sigma)，0.15mmol/L EDTA，Hanks液(自备)，兔抗大鼠IgG(GFAP,Sigma)，小鼠抗大鼠IgG(NF200,Sigma)，羊抗小鼠TRITC(IgG荧光控制体，北京中山公司)，0.4%TritonX100，甲醇，30%H2O2，0.01M PBS(北京中山公司)。

　　3 实验方法

　　3.1 PAS的培养 新生2天的SD大鼠，无菌条件下剔除软脑膜及血管，取大脑皮层组织，剪碎，0.25%胰蛋白酶37℃消化30分钟，培养液(10%胎牛血清，2mmol/L L谷氨酰胺，0.6%葡萄糖，DMEM) 吹打成细胞悬液，接种于培养瓶，孵育30分钟，翻转瓶子吸出细胞悬液，接种于涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，密度为1×106个/ml，孵箱中培养，每3～5天换液1次。培养至14天后，向培养基中加入10mmol/L Lleucinemethylester并孵育1小时以杀死小胶质细胞，用新鲜培养基洗2次，孵育2小时，37℃摇床上以180r/min振荡16小时，O2A前体细胞被摇起，瓶中所剩的一层即为PAS。

　　3.2 PAS的鉴定

　　固定PAS细胞，用0.5%H2O2/甲醇灭活内源性过氧化物酶，0.4%TritonX100孵育，滴加正常山羊血清封闭，加入GFAP抗体37℃孵育2小时，羊抗小鼠TRITC荧光抗体IgG显色后DPX封片，激光共聚焦显微镜观察，激发波长为543nm，呈红色。

　　3.3 NSC的培养和鉴定 参见刘媛等[2]建立的方法。

　　3.4 NSC和PAS共培养

　　3.4.1 分组 根据NSC与PAS的比例分为4组：3:1组;2:1组;1:1组;1:2组，共培养10天。

　　3.4.2 NSC分化情况鉴定 经DAPI标记的NSC分化10天后，用NF200对分化神经元进行标记，用TRITC显色，方法同3.2部分。激光共聚焦显微镜观察，激发波长为543nm阳性细胞，呈红色。DAPI标记为蓝色，激发波长为380nm。

　　3.4 统计学处理 在显微镜下随机选取20个视野，每次计数100个细胞，计算神经元在NSC中所占的比例。实验数据用SPSS 10.0软件处理，结果以±s表示，组间差异采用单因素方差分析。

　　结果

　　1 PAS的鉴定结果分析

　　PAS外观扁平，胞体较大，折光性好，突起宽而扁，似荷包蛋样，分支较少(见图1)。

　　2 NSC与PAS共培养后分化比例分析

　　结果观察到NSC:PAS 2:1组分化得到的神经元数量最多，与分化的胶质细胞比例为65%:35%;而1:1组、3:1组稍低一些，比例分别为61%:39%和59%:41%;1:2组比例最低为57%:43%(见表1，图2、3)。

　　表1 神经干细胞与原浆型星形胶质细胞以不同比例共培养后的分化情况(略)

　　与2：1组比较：##P<0.01;与1：1组比较：△△P<0.01

　　图1 PAS组化鉴定共聚焦显微镜观察(GFAP红色荧光标记，胞体较大，圆盘状，突起宽而扁，分支少，形似绒球)(略)

　　图2 神经干细胞与原浆型星形胶质细胞以不同比例共培养后的分化情况(略)

　　a.NSC:PAS 3:1时分化神经元染色( ×100);b.NSC:PAS 2:1时分化神经元染色( ×100);c.NSC:PAS 1:1时分化神经元染色( ×100);d.NSC:PAS 1:2时分化神经元染色( ×100);DAPI(蓝色)标记NSC核;NF200(红色)标记神经元;B组分化神经元比例最高

　　图3 NSC与PAS在不同比例下共培养10天神经元分化的情况(略)

　　讨论

　　星型胶质细胞(astrocyte，AS)能分泌多种细胞因子，调控NSC分化，在神经发育及损伤再生中具有重要作用[3,4]，分为PAS和FAS两种类型。本室已在实验中观察到PAS比FAS更有利于NSC向神经元的分化[1]，但NSC与PAS以什么样的比例共培养才能更有利于NSC向神经元分化，进而满足脊髓损伤修复的要求?因此，筛选出NSC与PAS的最佳比例显得尤为重要。本实验结果显示，NSC:PAS比例为2:1时分化得到的神经元比例最高，而3:1组、1:1组、1:2组分化得到的神经元比例均明显低于2:1组。这可能是在2:1条件下PAS细胞培养液所提供的营养成分及生物活性分子的量最有利于NSC向神经元的分化，3:1条件下可能是由于NSC数量相对过多而PAS相对较少，使其能够分泌产生的NGF、BDNF、TGFβ等利于NSC向神经元分化的细胞因子相对不足而使这一分化过程受到了一定程度的抑制，在此情况下更利于NSC向胶质细胞方向的分化[5-7]。而1:1组、1:2组表现为神经元分化比例的递减趋势，说明细胞在共培养条件下可能存在竞争性生长抑制，特别是PAS生长代谢旺盛会大量消耗培养液中的营养成分，同时会产生更多的代谢产物，成为NSC增殖分化的不利因素，虽然PAS分泌促进NSC向神经元分化的细胞因子也会增加，但不足以完全抵消不利因素的影响，而且高比例的PAS分泌产生的CNTF、EGF以及高浓度的bFGF都促进了NSC向胶质细胞的分化，导致神经元分化比例降低。

　　NSC与PAS以2:1共培养条件下，PAS分泌产生的神经营养因子及细胞生长因子的有效剂量促进了NSC向神经元方向的分化，而向胶质细胞的分化途径受到了一定程度的抑制，使神经元的分化比例达到了65%。该结果和以往单一因子以及AS诱导NSC分化的国内外相关研究相比[7]，神经元分化比例较高，且本研究所采用的细胞调控方式更接近于在体的细胞生存状态。此外，PAS来自中枢更适应脊髓组织的微环境，它所诱导的脊髓源性NSC分化的神经元能更好地满足损伤脊髓的修复要求。这种细胞联合移植可能会对SCI的结构和功能修复产生积极作用。

　　【参考文献】

　　[1]曾琳，李民，刘媛，等.原浆型和纤维型星形胶质细胞调控神经干细胞定向分化的比较研究[J].创伤外科杂志，2007，9(2)：160-162.

　　[2]刘媛，龙在云，曾琳，等.不同培养条件对神经干细胞定向分化的影响[J].中国临床康复，2003，7(31)：4228-4229.

　　[3]Sugawara T,Lewen A,Noshita N,et al.Effects of global ischemia duration on neuronal,astroglial, oligdendroglial,and microglial reactions in the vulnerable hippocamoal CAI subregion in rats[J].Neurotrauma,2002,19(1):85-92.

　　[4]Miyazaki H,Nagashinan K,Okuma Y,et al.Expression of glial cell line derived neurotrophic factor induced by transient forebrain ischemia in rats[J].Brain Res,2001,922(2):165-173.

　　[5]Rossella G,Stefano AG,Pagano AG,et al.Regulation of neural differentiation in human CNS stem cell progeny leukemia inhibitor factor[J].Dev Neurosci,2000,22(1):86-95.

　　[6]Setoguchi T,Kondo T.Nuclear export of OLIG2 in neural stem cells is essential for ciliary neurotrophic factorinduced astrocyte differentiation[J].J Cell Biol,2004,166(7):963-968.

　　[7]Sun Y,Shi J,Lu PH.Neurotrophic factors and neural stem cells[J].Prog Physiol Sci,2002,33(4):313-316.