冻融异种神经匀浆结合硅胶管套接法修复周围神经缺损的实验研究

　　作者：朱天亮，蒋电明，顾玉荣 (重庆市第三人民医院骨科，重庆 400014;重庆医科大学附属一院骨科，重庆 400016)

　　摘要： 目的 探讨冻融异种神经匀浆结合硅胶管套接对周围神经再生的影响。方法 Wistar大鼠24只，分成2组，切断其右侧坐骨神经造成10mm缺损。A组于硅胶管内注入冻融异种神经匀浆悬浮液30μl，B组于硅胶管内注入30μl生理盐水。于术后16周分别进行大体、电生理、组织学观察和形态学分析。结果 A组的再生神经运动传导速度快于B组，再生有髓神经纤维数亦高于B组，经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。结论 深低温冷冻处理是一种有效的降低异种神经抗原性的方法，冻融异种神经匀浆有明显促神经再生作用。

　　关键词：冻融异种神经匀浆;硅胶管;神经再生;周围神经

　　Experimental study on repair of peripheral nerve defect by cryotreated xenogeneic nerve homogenate combined with graft conduit of silastic

　　ZHU Tianliang,JIANGg Dianming,GU Yurong

　　(Department of Orthopaedics,Third People’s Hospital，Chongqing 400014 China)

　　Abstract： Objective To explore the effect of cryotreated xenogeneic nerve homogenate combined with graft conduit of silastic on peripheral nerve regeneration.Methods Twentyfour adult Wistar rats were divided into two groups and their right sciatic nerves were transected to form a 10 mm gap.Cryotreated xenogeneic nerve homogenate suspension(30 μl) was injected into the graft conduit of silastic in group A,and saline solution(30μl) was injected into the graft conduit of silastic in group B.General observation,electrophysiological test,histological examination and morphometry were performed 16 weeks after surgery.Results The motor nerve conductive velocity found in group A was significantly faster than that of group B,and the amount of myelinated fibers found in group A was significantly larger than that in group B.Conclusion It is suggested that the cryotreated procedure is a good pretreatment method for peripheral nerve xenograft,and cryotreated xenogeneic nerve homogenate can markedly promote nerve regeneration.

　　Key words：cryotreated xenogeneic nerve homogenate;graft conduit of　silastic;nerve regeneration;peripheral nerve

　　材料与方法

　　1 实验动物及分组

　　1.1 冻融异种神经的制备 体重约2.5kg健康成年白兔1只，取出坐骨神经湿重约6g，剥离神经外膜后，用玻璃匀浆器碾磨成匀浆，并加入12ml生理盐水制备成异种神经匀浆悬浮液，等分装入12个编号为A1～A12无菌小瓶，入液态氮(-196℃)中冻存2～3周，并在每次移植手术前取出，经反复冰冻(低温冰箱，-20℃)、融解(室温，20℃)5次后，制备为经深低温处理的冻融异种神经匀浆组(A组)，然后行移植术。每次冰冻、融解各5分钟。

　　1.2 动物模型建立 取24只Wistar大白鼠，雌雄不限，体重200～250g，在1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(30mg/kg)下手术，显露右侧坐骨神经，距梨状肌下孔0.5cm处切断坐骨神经，并切除8mm长的神经远段，造成坐骨神经缺损。然后，均用90无创缝线缝过断端神经外膜，与桥接物缝合4～6针进行修复。硅胶管(内径1.8mm、长12mm)桥接要求神经远、近断端均拉入管内1～2mm，无反折、扭曲，并用凡士林将硅胶管两端封固。

　　1.3 实验分组 每只Wistar大白鼠均以左侧正常坐骨神经为自身对照;以右侧修复坐骨神经缺损的不同方法作为以下分组依据。

　　A组：冻融异种神经匀浆组。Wistar大白鼠12只，每只右侧坐骨神经缺损均用硅胶管桥接，用微量注射器在管内注入取自A1～A12的冻融异种神经匀浆悬浮液30μl。

　　B组：单纯硅胶管组。Wistar大白鼠12只，每只的右侧坐骨神经缺损均用硅胶管桥接，用微量注射器在管内注入生理盐水30μl。

　　2 观察指标

　　2.1 大体观察 术后定期观察大鼠的一般情况及失神经改变情况。

　　2.2 电生理 术后16周时，在腹腔麻醉下，采用HITACHI2000型肌电图仪进行检测。刺激电极置于桥接体近侧坐骨神经，记录电极置于胫前肌，记录神经肌肉动作电位(MAP)，比较运动神经传导速度、潜伏期、波幅。

　　2.3 组织学 电生理检测完毕，立即完整取下神经桥接体。其中每组随机取4只大白鼠双侧坐骨神经桥接体，置于3%磷酸缓冲的戊二醛固定液中，送电镜室经定向包埋、超薄切片，取桥接体中段行H600型透射电镜检查;其余大白鼠双侧坐骨神经桥接体，置于20%甲醛固定液中固定7天后，脱水、包埋、4～6μm半薄切片，取桥接体远、中、近3段作HE和甘氨酸银染色，观察轴突生长情况。

　　2.4 有髓神经纤维计数 将甘氨酸银染色的桥接体中段半薄切片，置于CM2000B型生物医学图像分析系统下行再生坐骨神经有髓纤维计数。

　　3 统计学处理

　　本文中实验数据以均数+标准差(±s)表示，采用χ2检验和自身配对t检验进行统计学处理。

　　结果

　　术后对24只大鼠定期观察、记录一般情况。各组均于术后16周时取桥接体作电生理、组织学检查和有髓神经纤维计数。

　　1 大体观察 每只大鼠术后即出现右下肢瘫痪，拖地爬行，足不能背伸。术后2周左右，大鼠右后肢肿胀、踝关节处出现溃疡。以后各组大鼠的右下肢大体观察记录如下。

　　A组：术后8～10周，8只大鼠踝关节溃疡愈合，肢体肿胀较前减轻。术后12～14周，11只大鼠肢体肿胀消退。术后16周时，11只大鼠恢复足部背伸活动，步态好转，仍有跛行和步态不协调;硅胶管桥接体内见连接坐骨神经近远端有完整包膜的束状组织，质地与左侧正常坐骨神经相近，直径均较左侧坐骨神经小。

　　B组：术后8～12周，12只大鼠踝关节溃疡均未愈合，肢体肿胀明显。术后12～14周，5只大鼠踝关节溃疡愈合，肢体肿胀消退，足部背伸活动部分恢复，但跛行步态和不协调明显。术后16周时，7只大鼠恢复足部背伸活动，步态好转，但仍有跛行;硅胶管桥接体内均见连接坐骨神经近远端有完整包膜的、非常细小的束状组织，质地与左侧正常坐骨神经相近。

　　2 电生理检测结果显示，再生神经运动传导速度恢复率A组比B组高，并有显著性差异(P<0.05)，结果见表1。

　　表1 再生神经运动传导速度恢复率(略)

　　再生神经运动传导速度恢复率=再生神经运动传导速度/健侧神经运动传导速度

　　3 组织学检查 神经移植术后，桥接体中段各成活期的神经切片经甘氨酸银染色，光镜下再生神经呈棕黑色。A组再生神经纤维整齐地紧密排列，间质组织较少;B组再生神经纤维排列规则，与A组类似，但较稀疏。

　　桥接体中段超薄切片在电镜下检查，A组大量再生有髓纤维和无髓纤维，再生神经纤维聚集成束，外包有神经束膜;再生神经的轴突内微丝、微管、线粒体丰富，许旺细胞成熟，细胞外有完整的基膜包绕，1个许旺细胞包绕多根再生神经轴突;再生神经轴突髓鞘较厚、排列紧密，有髓纤维之间可见较少的无髓纤维;少数再生神经轴突内线粒体肿胀、空泡化，髓鞘有板层分离、内陷等破损表现，可见浆细胞和吞噬细胞碎片。B组可见再生神经轴突粗细不等，无髓纤维比有髓纤维多见，轴突之间有一个或多个未成熟许旺细胞，髓鞘薄，线粒体不丰富。

　　4 有髓神经纤维计数发现，A组再生神经纤维恢复率比B组高，并有显著性差异(P<0.05)，结果见表2。

　　表2 再生神经纤维恢复率(略)

　　再生神经纤维恢复率=再生神经纤维轴突面积/健侧神经纤维轴突面积

　　5 同一桥接体的中段、远段组织的甘氨酸银染色切片，进行有髓神经纤维计数的统计学自身配对t检验。再生神经纤维数和再生神经纤维轴突面积的统计学结果在每一桥接体的中段、远段部位无显著性差异，提示再生神经纤维通过桥接体由近端向远端生长，并长入远端的终末器官，桥接体中段甘氨酸银染色切片有髓神经纤维计数结果可以代表再生神经纤维数。

　　讨论

　　周围神经缺损后的再生神经纤维修复，是通过轴突向靶器官的生长延伸来完成。在损伤后头4个月内，失神经支配的神经内膜管进行性塌陷。延迟超过4个月的周围神经修复，将导致许多再生神经纤维直径上永久性缩小和髓鞘化的减少，继而明显功能恢复障碍。因此，在损伤后前4个月内尽快完成再生神经纤维修复，是最大限度地改善周围神经功能恢复的基础。理想的损伤神经修复应该最大限度地发挥神经趋化性、神经营养性和接触引导三者的作用。

　　近年来，已成功地从周围神经Schwann细胞胞浆提取多种神经营养因子(NTFs)，如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等[1]，提示许旺细胞胞浆富含多种神经营养蛋白。一些实验研究已证实外源性NTFs生物活性浓度在10-6～10-9mg/ml即可表现出显著的生物效应，促进周围神经再生，而对许旺细胞中相应的内源性NTFs基因表达影响不大[2]。外源性NTFs可从以下4个方面促进神经再生和成熟：(1)在早期，再生轴突生长冠从其周围微环境中摄取外源性NTF，通过轴浆逆向运输使神经元获得持续的营养支持，减少神经元细胞死亡和凋亡数量，为以后的轴突再生提供了物质基础[3];(2)直接作用于再生轴突：多种NTFs分别与再生轴突上存在的相应受体结合，发挥其神经趋化作用，引导再生轴突生长方向，加快再生轴突生长速率及增加其数量[4];(3)调控宿主许旺细胞增殖、分化：如纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子(IGF)能刺激许旺细胞有丝分裂和迁移，FGF还能促进许旺细胞合成DNA及表达NGF[5];NGF则上调许旺细胞低亲和力NGF受体P75的表达，减少神经元凋亡，促进许旺细胞迁移和形成髓鞘[6];(4)促进再生神经血管形成：如NGF、FGF能增加再生神经的血管密度和数量，以满足神经再生时物质代谢需要[7]。但单用一种NTFs仅对部分神经元起一定作用，且剂量和副作用大,难以取得满意的促进神经再生作用[8]。以正常的异种坐骨神经为原料，通过剥离神经外膜制作的神经匀浆，富含许旺细胞基底膜和许旺细胞的胞浆，其内神经营养蛋白丰富，有多种外源性NTFs，是天然的NTFs来源，而且其NTFs种类、组成比例非单一NTFs或人工复合多种NTFs所能及的。

　　异种神经匀浆作为移植实验中的供体，依然存在免疫排斥问题。如何降低异种神经的抗原性，是减弱或避免移植免疫排斥反应的关键。对于异种神经的主要抗原成分，目前尚存在争议。一般认为，异种神经的抗原性主要存在于异种神经活性许旺细胞的膜蛋白，而其中细胞内粘附分子1(ICAM1)和主要组织相容复合体Ⅱ(MHCⅡ)是主要的多肽抗原[9]。深低温冷冻不仅是一种有效的器官保存方法，而且还可以调节移植物的免疫原性，减少排斥反应的发生，这已被多种动物及人体的冻存器官移植实验研究所证明[10]。用液氮冷冻保存2～3周的神经桥接体，许旺细胞膜上的ICAM1和MHCⅡ表达明显降低，桥接体的抗原性亦明显降低，而许旺细胞仍保留活性[11]。通过反复冷冻、融解的方法，选择性杀伤低温敏感免疫活性许旺细胞，使许旺细胞膜破裂，一方面，可以使许旺细胞内的多种NTFs保留活性，并释放出来;另一方面，许旺细胞膜上包括ICAM1和MHCⅡ在内的抗原性膜蛋白易于被宿主巨噬细胞清除。这样的冻融异种神经匀浆，易于诱导移植耐受，减轻免疫反应，防止移植排斥，而其内丰富的活性NTFs有利于诱导、促进轴突再生，因此，A组冻融异种神经匀浆复合桥接体中神经再生较好。

　　冻融异种神经匀浆作为一种富含多种NTFs的促神经生长物质，与各种纯化NTFs和自体神经移植相比，具有材料来源丰富、制作容易、程序简单的优点。硅胶管生理惰性好，无抗原性，对人体组织无刺激，无致癌作用，植入体内异物反应小[12]，与冻融异种神经匀浆结合形成的桥接体管腔不易塌陷，创立一种神经再生室，调节周围神经再生，使神经近端再生的轴索可顺利通过，减少瘢痕干扰，跨越缺损长入远端，早期完成神经修复。但硅胶管不具有羊膜、骨骼肌等生物桥接体的基底膜样结构，缺乏接触引导作用，并可能妨碍营养血管的长入，使神经缺损的修复长度有限。冻融异种神经匀浆宜于神经生长的最佳稀释浓度、冻融处理的时间和温度、结合何种修复周围神经缺损的桥接材料，能更有效地促进周围神经再生，有待进一步研究。

　　参考文献：

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