人参皂甙Rb1对短暂脑缺血后神经元损伤的保护作用

　　作者：罗天飞 刘姗姗 葛鹏飞 张纪周 洪敏 作者单位：吉林大学白求恩医学部，吉林 长春 130021　1 吉林大学第一医院整形外科2 吉林大学第一医院神经外科3 吉林大学白求恩医学部生物化学及分子生物学教研室

　　【摘要】目的 探讨人参皂甙Rb1对缺血后神经元损伤的保护作用。方法 Wistar大鼠36只，随机分为假手术组、对照组和人参皂甙Rb1组，每组12只。对照组和人参皂甙Rb1组采用双侧颈总动脉暂时夹闭法制备大鼠全脑缺血模型，假手术组仅行手术而不进行缺血。人参皂甙Rb1组模型制备前3 d给药30 mg/kg，持续给药至缺血后3 d，共6 d。三组大鼠均在缺血后3 d处死。采用HE染色及光镜观察计数CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元死亡数量。蛋白印迹分析bcl2及bax的表达。结果 缺血组中海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元死亡率分别为：(98.2±1.1)%、(95.5±2.2)%、(54.3±11.5)%、(11.7±4.3)%、(23.1±8.6)%;人参皂甙Rb1组各脑区的死亡率分别下降至(55.2±9.7)%、(5.4±2.4)%、(4.3±3.1)%、(2.4±1.2)%、(3.7±1.9)%，与缺血组相比较死亡率显著下降(均P<0.01)。与对照组相比，缺血后的CA1、DG及皮层区神经元内bcl2表达显著减少，而bax表达显著增加。与缺血组相比较，Rb1组中CA1、DG及皮层神经元内的bcl2表达显著增加，而bax表达显著减少。结论 人参皂甙Rb1通过上调bcl2的表达及下调bax的表达来实现对缺血后神经元损伤的保护作用。

　　【关键词】 人参皂甙Rb1 脑缺血

　　人参皂甙Rb1是从人参中提取的有效成分，对外伤后神经细胞损伤具有保护作用〔1〕。本实验采用大鼠全脑缺血模型，研究人参皂甙对缺血后神经元损伤的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　雄性Wistar大鼠36只，280～320 g，吉林大学实验动物部提供。随机分为假手术组、对照组和人参皂甙Rb1组，每组12只。

　　1.2 试剂与仪器

　　人参皂甙Rb1由吉林大学白求恩医学部有机化学教研室惠赠。多克隆bcl2抗体、多克隆bax抗体购自美国Cell signaling公司，其他试剂均购自Sigma公司。光学显微镜为日本产Olympus BX51型，震动切片机为德国产Leica VT1000S型。

　　1.3 方法

　　1.3.1 模型的制备〔2〕

　　全脑缺血模型的制备采用双侧颈总动脉暂时夹闭法。动物禁食一夜，随意饮水。先以5%(30%O2，70%N2O)氟烷诱导麻醉，然后以2%浓度维持麻醉。尾动脉插管监测动脉血压，同时注射0.05 ml(150 IU/kg)肝素。右侧股动脉插管备用。颈部正中直切口，分离双侧颈总动脉。颞肌下和直肠内分别插入热敏探头，监测头温和体温;手术过程中用恒温毯将头温和体温保持在36.8℃～37.2℃。缺血时先用动脉瘤夹夹闭双侧颈总动脉，然后经股动脉抽血将动脉压降至50 mmHg，缺血时间为15 min。缺血结束后，除去动脉瘤夹并将血液回输。假手术组仅行手术而不进行缺血;对照组为正常缺血组;人参皂甙Rb1组模型制作前3 d给药30 mg/kg，持续给药至缺血后3 d，共6 d。三组动物均在缺血后3 d处死。

　　1.3.2 脑组织HE染色

　　将大鼠麻醉、气管插管后连接呼吸机，以3%的氟烷维持麻醉，打开胸腔，暴露心脏，左心室内注射0.1 ml(300 IU/kg)肝素后，将导管经左心室插入主动脉，先以4℃的PBS液冲洗3 min，然后用4℃含有4%多聚甲醛的PBS液灌注3 min，取出脑组织，放于含有4%多聚甲醛的PBS液中固定24 h(4℃)。用震动切片机按13 μm层厚行冠状位切片，挑选背侧丘脑处的脑片用于HE染色。HE(苏木素伊红)染色：将载有脑片的载玻片放置于背光处阴干，用梯度乙醇溶液脱水后置于苏木素溶液中15 s，冲洗干净后，放入Scott溶液中10 s，冲洗后放入伊红溶液中10 s，再经乙醇溶液脱水后进行透明处理，加盖玻片。每个切片均在40倍物镜下任意选择三个视野计算死亡细胞百分比(死亡细胞数/总细胞数)。

　　1.3.3 细胞浆分离〔3〕

　　大鼠缺血再灌注36 h后麻醉，迅速断头，分离海马CA1区、DG区及皮层脑组织，用液氮冷冻保存。将脑组织称重后，按照重量体积比1∶10加入匀浆缓冲液(1.5 mmol/L Tris baseHCl pH 7.6，1 mmol/L DTT，0.25 mol/L 蔗糖，1 mmol/L MgCl2，1.25 μg/ml pepstatin A，10 μg/ml leupeptin，2.5 μg/ml aproptonin，0.5 mmol/L PMSF，2.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，0.1 mol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF，2 mmol/L 焦磷酸钠)，匀浆器抽压35次。匀浆组织液以4℃ 800 g离心10 min，将抽取的上清以4 ℃ 165 000 g离心1 h后所得的第二次上清即为胞浆组分。Bradford法测定蛋白浓度后，将其保存于-20℃冰箱备用。

　　1.3.4 蛋白印迹分析

　　SDSPAGE凝胶电泳。0.45 μmPVDF膜湿法电转膜。室温下3%BSA封闭1 h。置于摇床上与抗bcl2多克隆抗体(1∶1 000)及抗bax 多克隆抗体(1∶1 000)4℃下孵育过夜。室温下与二抗(抗兔)孵育1 h。再与ECL一起孵育1 min，然后经过曝光，显影，冲洗，定影等步骤，将冲洗后的胶片扫描到电脑中，用Kodak 1D软件测定每一个条带的灰度值。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据以x±s表示，用STATA10.0统计软件进行数据处理。

　　2 结 果

　　2.1 海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元死亡数量

　　见图1。在显微镜下，死亡神经元呈现胞核固缩深染，呈现多角形，胞浆粉染。假手术组中，海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层各脑区神经元死亡率为0。缺血组中海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元死亡率分别为(98.2±1.1)%、(95.5±2.2)%、(54.3±11.5)%、(11.7±4.3)%、(23.1±8.6)%;人参皂甙Rb1组各脑区的死亡率分别下降至(55.2±9.7)%、(5.4±2.4)%、(4.3±3.1)%、(2.4±1.2)%、(3.7±1.9)%。与缺血组相比较人参皂甙Rb1组各脑区的死亡率显著下降(均P<0.01)。

　　2.2 蛋白印迹

　　见图2。与对照组相比，缺血后bcl2表达在DG区明显减少(P<0.05)，在CA1区及皮层区神经元内显著减少(均P<0.01);而bax表达在CA1区、DG区及皮层区均显著增加(均P<0.01)。与缺血组相比，Rb1组在CA1区、DG及皮层神经元内的bcl2表达均显著增加(均P<0.01)，而bax表达在DG区明显减少(P<0.05)，在CA1区及皮层区均显著减少(均P<0.01)。

　　3 讨 论

　　1982年Kirino〔4〕报道了短暂脑缺血后海马CA1区神经元延迟性死亡现象，即当缺血结束时CA1区神经元并不马上死亡，而是在再灌注若干天后才发生死亡。此后，有学者发现，延长缺血时间，海马CA2区、CA3区、DG区及皮层神经元均能发生延迟性死亡。本文发现对照组中海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元表现胞核固缩深染、呈多角形、胞浆粉染，均为神经元死亡的病理特征，但假手术组中各脑区的神经元无死亡;在对照组海马CA1区和CA2区神经元几乎全部死亡;CA3区神经元大约有半数死亡;DG和皮层神经元死亡较少。我们以往研究发现，较短时间缺血后，只有海马CA1区神经元死亡，而其他各脑区则无神经元死亡。因此，认为 各脑区神经元死亡的差异可能与各区神经元对缺血耐受程度不同有关。

　　有学者〔5，6〕发现人参皂甙Rb1能够延长原代培养的大鼠海马神经细胞存活时间、降低神经细胞的死亡率，并研究了人参皂甙Rb1对局灶性脑缺血的保护作用。但是人参皂甙对短暂脑缺血后大鼠海马及皮层各脑区神经元的影响尚不清楚。我们在缺血前3 d采用腹腔注射的方法给予人参皂甙Rb1，然后进行15 min全脑缺血，结果发现与对照组相比较海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元的死亡率均显著减少。同时采用差速离心分离了CA1区、DG区及皮层神经元的细胞浆，结果发现人参皂甙Rb1对神经元的保护作用是通过上调凋亡抑制基因bcl2及下调凋亡促进基因bax实现的，这与采用外伤模型研究人参皂甙Rb1保护神经元损伤的结果一致。因此，认为人参皂甙保护神经元抵抗缺血性损伤的作用是通过上调bcl2和下调bax基因实现的。人参皂甙保护神经细胞的作用机制：①人参皂甙Rb1调节凋亡调控基因的表达，Bcl2蛋白的表达与人参皂甙Rb1的浓度呈正比，而Bax 蛋白的表达与人参皂甙Rb1的浓度呈反比〔7〕。②人参皂甙Rb1能够增加细胞膜的稳定性，减少神经细胞LDH的释放量〔8〕;③人参皂甙Rb1能够清除自由基，抑制脂质过氧化物形成〔9〕。本研究证实了人参皂甙对全脑缺血后大鼠各脑区的保护作用，但是缺血再灌注后神经元延迟性死亡的机制是复杂的，既有自由基的形成、钙离子的超载，也有蛋白质代谢障碍等原因。因此，尚有待进一步阐明人参皂甙Rb1脑保护的机制。

　　【参考文献】

　　1 Sakanaka M，Zhu P，Zhang B,et al.Intravenous infusion of dihydroginsenoside Rb1 prevents compressive spinal cord injury and ischemic brain damage through upregulation of VEGF and BclXL〔J〕.J Neurotrauma，2007;24(6)：103754.

　　2 葛鹏飞，罗毅男，付双林，等.缺血再灌注后皮层神经元内蛋白酶复合体活性变化与神经元死亡的关系〔J〕.中华医学杂志，2007;87(9)：6379.

　　3 Liu CL，Ge P，Zhang F，Hu BR.Cotranslational protein aggregation after transient cerebral ischemia〔J〕.Neuroscience，2005;134：127384.

　　4 Kirino T.Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia〔J〕.Brain Res，1982;239(1)：5769.

　　5 刘文心，张均田.人参皂苷Rb1和Rg1对原代培养大鼠海马神经细胞的保护作用〔J〕.药学学报，1995;30(9)：6748.

　　6 张英鸽，刘天培.人参皂甙Rb1和Rg1对大鼠可逆性脑缺血的影响〔J〕.中国药理学报，1996;17(1)：448.

　　7 李爱红，柯开富，包仕尧，等.人参皂甙Rb1、Rb3、Rg1对培养小鼠皮层细胞缺血损伤的保护作用及浓度效应关系〔J〕.脑与神经疾病杂志，2003;11(2)：726.

　　8 Bae EA，Hyun YJ，Choo MK，et al.Protective effect of fermented red ginseng on a transient focal ischemic rats〔J〕.Arch Pharm Res，2004;27(11)：113640.

　　9 Shen L，Zhang J.Ginsenoside Rg1 increases ischemiainduced cell proliferation and survival in the dentate gyrus of adult gerbils〔J〕.Neurosci Lett，2003;344(1):14.