兔外伤性视神经损伤后不同时期减压的形态学观察

兔外伤性视神经损伤后不同时期减压的形态学观察作者：吴昆旻    作者单位：中国人民解放军南京军区南京总医院 1. 耳鼻咽喉科； 2. 病理科； 3. 神经外科， 江苏 南京 210002    【摘要】  目的 观察视神经损伤模型在损伤后不同时期减压的形态学改变，了解其与手术时机的关系。 方法 建立家兔外伤性视神经损伤模型，将损伤分为正常对照组、损伤48 h减压组、7 d减压组、14 d减压组及损伤不减压组，在光镜下观察各组视神经的组织形态学改变。 结果 正常对照组视神经纵切面胶质细胞基本呈柱形均匀排列，神经纤维排列整齐。损伤48h减压组纵切面胶质细胞排列基本均匀，损伤处可见空泡样变性，可见少量胶质细胞增生。损伤7 d减压组纵切面胶质细胞排列紊乱，大部分区域出现多个大小不等的空泡，部分区域出现脱髓鞘样变，胶质细胞增生明显。损伤14 d减压组纵切面胶质细胞完全丧失柱形排列，胶质细胞明显增生，视神经脱髓鞘样变明显。损伤不减压组可见大片神经纤维坏死，视神经脱髓鞘样变明显，胶质细胞增生。 结论 神经元继发性损伤是视功能进行性下降的重要原因，视神经减压术有利于减轻视神经的间接损伤，较早期进行减压 （48 h） 可阻止轴突继发性损伤。    【关键词】  视神经损伤 模型 动物 病理学    Morphological changes of optic nerve decompressed at different time periods following the traumatic optic nerve injuries in rabbits  WU Kunmin, XUE Fei, LI Zeqing, et al. Department of Otorhinolaryngology, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Nanjing 210002, China    Abstract:  Objective  To observe the relations of morphological changes duo to decompression at different time periods to surgical timing for traumatic optic nerve injuries.  Methods  Animal models of traumatic optic nerve injuries were established. The animal models were divided into 5 groups: control group, non-decompression group and decompression groups (48 h, 7 d, 14 d after injury). At the same time, the morphological changes of optic nerve were observed under light microscope.  Results  In the control group, the optic nerve astrocytes presented as cylinder type and arranged regularly on the vertical section, and the neural fibers arranged neatly. In 48 h decompression group, the arrangement of astrocytes was basically regular on vertical section, and vacuoles and slight astrocyte hyperplasia were observed in the damaged area. In 7 d group, the arrangement of astrocytes was irregular on vertical section. A lot of vacuoles with various sizes, demyelination of the nerve, uncovered axons, and astrocyte hyperplasia were observed in most areas. In 14 d group, the cylindric arrangement of astrocytes disappeared completely and obviously. The astrocyte hyperplasia in the full vision field and obvious nerve demyelination were noted. In non-decompression group, necrosis in flakes, obvious nerve demyelination and astrocyte hyperplasia were found.  Conclusion  It is confirmed that the excessive loss of neurons due to secondary degeneration following optic nerve injuries is the most important factor for visual impairment. The optic nerve decompression is benefit to protection of visual function in indirect optic nerve injuries. Visual function is better improved by decompression in 48 hours.    Key words:  optic nerve injuries;  model, animal;  pathology    外伤性视神经损伤 （Traumatic optic neuropathy，TON） 是外伤引起的视力部分或全部、暂时或永久丧失导致失明，是伤后致残的常见原因之一。本研究通过建立视神经间接损伤的动物模型，以观察损伤模型中不同时期减压后视神经的组织形态学改变，以研究TON的机制，了解TON的手术时机与手术疗效之间的关系，为临床选择TON的手术时机提供理论依据。现报告如下。1    材料与方法    1.1    实验材料与分组　　  健康雄性成年新西兰白兔 （体质量2.0~3.0 kg） 由南京军区南京总医院动物实验中心提供，实验动物机构许可证号：SYXK （军） 2002-045。检查双眼屈光间质清，瞳孔等大等圆，对光反应好，眼底无异常。随机 （随机数字表法） 分为5组[1]：正常对照组、损伤48 h减压组、7 d减压组、14 d减压组及损伤不减压组，每组6只。每只动物左眼为试验眼。喂养条件：室内温度、湿度适宜，通风光线好，自由饮食。    1.2    视神经挤压伤动物模型[2]的建立    采用氯氨酮 （50 g/L） 按100 mg/kg的用量以肌肉注射的方式麻醉家兔。经眶上缘打开Tenon囊，分离上、内直肌并剪断，沿颞侧巩膜表面钝性分离，暴露视神经孔，在视神经孔中塞入一细端直径为2 mm，尾端直径为4 mm，高为3 mm的圆锥软硅胶，纵行阻塞视神经孔，仅留尾端0.5 mm，置银夹固定，造成视神经挤压伤。术后第2天瞳孔在4.5 mm以上、直接对光反射消失、眼球无明显突出者为成功模型，视神经减压即手术取出硅胶。    1.3    视神经形态学观察　　  损伤后减压组的实验动物于减压后14 d处死，取视神经固定于10%甲醛溶液，常规脱水石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光镜下观察。不减压组动物于损伤后4周处死，处理同前。并取正常对照组视神经标本作对照。形态学观察内容包括视神经是否肿胀、轴索是否变性、髓鞘是否脱失、胶质细胞是否增生及视神经内血管病变等。2    结    果    对照组视神经纵切面 （图1A） 神经纤维排列整齐，纵向平行排列，间隔均匀，基质淡红染，无炎性细胞浸润，间质有丰富的薄壁血管。横切面 （图1B） 神经纤维排列整齐，轴索存在，间隔均匀，血管形态良好。    损伤后48 h减压组视神经纤维排列基本均匀，损伤处可见少量空泡样变性，视神经稍肿胀，血管周围稍有渗出 （图2）。损伤后7 d减压组视神经损伤区域可见切面胶质细胞排列紊乱。大部分区域出现多个大小不等的空泡，部分区域出现脱髓鞘样变，部分轴突裸露，血管周围渗出明显，局部胶质细胞增生明显 （图3）。损伤后14 d减压组视神经损伤区域可见神经纤维坏死，视神经脱髓鞘变性，胶质细胞增生，灶性淋巴细胞浸润，胶质细胞排列紊乱，部分轴突裸露，血管周围渗出明显，局部可见血管增生明显 （图4）。    损伤后不减压组视神经损伤区域可观察到大片神经纤维坏死，视神经脱髓鞘变性，间质黏液变性，胶质细胞增生，厚壁小血管增生，灶性淋巴细胞浸润（图5）。3    讨    论    　 视神经损伤是头颅外伤的严重合并损伤，国内外学者建立了一系列的视神经损伤动物模型，有视神经横断伤、钳夹伤、牵拉伤、挤压伤等[3-5]，这些模型各有利弊。视神经横断伤将视神经在视交叉前任一部位切断，造成所有视网膜视神经节细胞轴突完全离断，可以保证各实验动物致伤量一致，便于对照研究，但对实验动物损伤较大，且视神经损伤后视网膜视神经节死亡的严重程度与时间进程、损伤部位距视盘的距离及损伤形式有关，但对于研究视神经钝挫伤机制的意义不大。视神经钳夹伤动物模型的共同特点是使用不同的致伤器将视神经在视交叉前任一部位夹伤，保持神经外膜的完整性；该模型设计简单，便于操作，可确切的造成视神经损伤，致伤成功率高。采用结膜入路暴露视神经，对实验动物的创伤较轻，动物死亡率低，可部分定量，重复性较好，比较接近临床，目前使用较广泛，但其致伤程度对操作者依赖性较大，不同操作者所造成的视神经损伤程度难以保持一致，且损伤程度难以精确定量。视神经牵拉伤动物模型分为与视神经管轴方向一致的牵拉和垂直于视神经管轴方向的牵拉，前者可确切的造成弥漫性轴索损伤，后者类似视神经管骨折所致切割伤，但较难保持致伤量的一致性。视神经挤压伤动物模型，类似眶内肿物及临床视神经间接损伤时周围组织挤压视神经造成的损伤，手术简单，易于操作，造成视神经损伤确切，对实验动物创伤较小，便于术后护理及进一步观察，通过控制挤压物的细端大小及置入深度，从病理观察结果可看出：视神经挤压伤是不完全性的，程度基本一致。本研究采用圆锥软硅胶，阻塞视神经孔，造成视神经挤压伤。    　视神经间接损伤后主要表现为肿胀、髓鞘脱失及轴突改变。本研究由于损伤后减压时间不同，在减压后视神经形态学的改变并不相同。在伤后48 h减压组的视神经标本中，视神经轻度水肿，毛细血管周围稍有渗出，损伤处可见空泡样变性，局部少量胶质细胞增生，但纵切面胶质细胞排列基本均匀；而随着减压时间的推后，髓鞘脱失逐渐加重，并伴随出现损伤区域坏死，胶质细胞排列紊乱，增生明显。本实验结果表明：随着减压时间的推移，视神经挤压伤局部出现由轻至重的病理变化，损伤不减压组在伤后14 d可出现明显的脱髓鞘改变和胶质细胞增生。实验表明：视神经损伤后第1周在电镜下出现髓鞘向内向外突起，板层分离和崩解等脱髓鞘现象，范围逐渐变大，程度逐渐加重，伴轴突空泡样变，微丝微管消失，14 d已崩解的髓鞘在逐渐清除，而新的脱髓鞘现象和轴突空泡样变性仍在继续，这提示视神经直接损伤造成早期视神经髓鞘和轴突变形崩解，而接下来继发性损伤导致髓鞘和轴突进行性溃变[6]。    　 国内外学者对视神经损伤后的视网膜视神经节细胞 （retinal ganglion cells，RGCs） 的数量进行定量[6-7]，发现损伤后前14 d是RGCs的快速减少期，14 d时减少约50%，后14 d是RGCs的缓慢减少期。由此可见，视神经的直接损伤效应造成部分轴突损伤，从而诱导RGCs急性丢失。受损的RGCs释放细胞毒素，胞内钙离子超载，自由基和谷氨酸水平升高等一系列的改变，导致轴突完好无损或轴突处于损伤边缘的RGCs继发变性[8-9]。因此，在视神经损伤后，如果能采取一切积极有效的措施，可减少和延缓RGCs的继发性损伤，否则终将发生变性[10]。    　　总之，本实验成功建立了家兔视神经挤压伤的动物模型，并观察了伤后不同时期减压时的视神经病理变化，揭示神经元继发性损伤是视功能进行性下降的重要原因，保护无原发损伤的神经元免受继发性损害是视神经保护的重要方面。视神经减压术可减轻视神经的间接损伤，视神经损伤后早期减压较远期减压能更好地保护视功能，在一定程度上可避免视功能进一步下降，并部分逆转视神经功能的损害。【参考文献】[1] MATTEINI C, RENZI G, BECELLI R, et al. Surgical timing in orbital fracture treatment: experience with 108 consecu- tive cases [J]. J Craniofac Surg, 2004, 15(1): 145-150.[2] 史剑波, 文卫平, 许庚, 等. 外伤性视神经损伤手术时机选择的实验研究 [J]. 中山大学学报, 2003, 24(4): 368-370, 397.[3] KLOCKER N, ZERFOWSKI M, GELLRICH N C, et al. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve [J]. J Neurosci Methods, 2004, 110(1-2): 147-153.[4] GELLRICH N C, SCHIMMING R, ZERFOWSKI M, et al. Quantification of histological changes after calibrated crush of the intraorbital optic nerve in rats [J]. Br J Ophthalmol, 2002, 86(2): 233-237.[5] BAIN A C, MEANEY D F. Tissue-level thresholds for axonal damage in an experimental model of central nervous system white matter injury [J]. Biomech Eng, 2000, 122(6): 615-622.[6] 胡爱莲, 孙葆忱, 李辽青, 等. 大鼠视神经夹挫伤视网膜视神经病理学动态观察及功能检测 [J]. 眼科, 2003, 12(6): 357- 360.[7] CHEN H, WEBER A J. BDNF enhances retinal ganglion cell survival in cats with optic nerve damage [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001, 42(12): 966-974.[8] THALE A, JUNGMANN K, PAULSEN F. Morphological studies of the optic canal [J]. Orbit, 2002, 21(2): 131-137.[9] POVLISHOCK J T, CHRISTMAN C W. The pathobiology of traumatically induced axonal injury in animals and humans: a review of current thoughts [J]. J Neurotrauma, 1995, 12(4): 555-564.[10] YOLES E, MULLER S, SCHWARTZ M. NMDA-receptor antagonist protects neurons from secondary degeneration after partial optic crush [J]. J Neurotrauma, 1997, 14(9): 665- 675.