脑胶质瘤中BAI1基因转录表达的研究

作者:陈善文,肖新如

     作者单位：首都医科大学附属北京天坛医院神经外科， 北京 100050          【摘要】  目的 探讨BAI1 mRNA表达水平与不同级别胶质瘤间的关系。 方法 选取病理分级为WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ级脑胶质瘤标本依次为12例、12例、14例，正常脑组织标本6例；提取总RNA，用半定量RT-PCR法检测BAI1基因的转录表达情况。 结果 BAI1 mRNA在所有正常脑组织和26例 （68.4%） 胶质瘤中表达。正常脑组织的BAI1基因转录表达水平高于胶质瘤组，P ＜0.05；各级胶质瘤间BAI1基因转录表达水平差异没有统计学意义。 结论 BAI1基因在胶质瘤中的转录表达水平显著性下降，在部分胶质瘤中表达缺失。BAI1可能与胶质瘤的发展有关。BAI1基因在胶质瘤中的转录表达水平与胶质瘤的级别无关。

    【关键词】  神经胶质瘤 脑特异性血管生成抑制因子 基因表达

    Research of transcriptional expression of gene BAI1 in glioma

    CHEN Shanwen, XIAO Xinru, WANG Shuo

    Department of Neurosurgery, Affiliated Tiantan Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China

    Abstract:  Objective  To explore the relationship between grading of glioma and BAI1 mRNA.  Methods  Total RNA were extracted from 6 control brain tissue samples and 12 grade Ⅱ, 12 grade Ⅲ and 14 grade Ⅳ glioma samples respectively. The expression level of BAI1 mRNA was measured by semi-quantitative RT-PCR.  Results  BAI1 mRNA was found in all the normal cerebral tissues and 26 of 38 gliomas (68.4%). The expression level of BAI1 mRNA was significantly higher in normal cerebral tissues than in gliomas (P < 0.05), but there was no statistical difference between the glioma samples.  Conclusion  The transcriptional expression of gene BAI1 is significantly decreased in gliomas, and even lost in some of them. The expression level of gene BAI1 is not related to the grading of glioma.

    Key words:  glioma;  brain-specific angiogenesis inhibitor;  gene expression

     近年来，研究发现：脑特异性血管生成抑制因子 （brain-specific angiogenesis inhibitor 1，BAI1） 具有抑制血管增生作用，并特异性在脑组织中表达[1]。BAI1表达缺失可能与胶质母细胞瘤 （GBM） 的发生、发展有关[2]。本研究采集不同级别的胶质瘤标本，检测BAI1基因的转录表达，探讨BAI1 mRNA随胶质瘤级别升高的变化情况。

    1    对象与方法

    1.1    研究对象    38例脑胶质瘤标本均来源于2006年4月~11月的我院手术切除标本，其中男17例，女21例；年龄9～76岁，平均 （43.2 ± 15.1） 岁。均经常规病理检查，按2000年世界卫生组织 （WHO） 中枢神经系统肿瘤分类标准确定病理诊断和分级，其中Ⅱ级 （星形细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、少枝-星形胶质细胞瘤） 12例，Ⅲ级 （间变性星形细胞瘤、间变性少枝胶质细胞瘤、间变性少枝－星形细胞瘤） 12例，Ⅳ级 （GBM） 14例。对照脑组织标本6例，取自同期癫病例手术切除的颞叶脑组织，其中男2例，女4例；年龄14～60岁，平均 （30.7 ± 17.0） 岁。标本切除后10 min内分块，置于液氮罐内冷冻贮存，－80 ℃长期冻存备用。

    1.2    半定量RT－PCR    采用Trizol试剂 （Invitrogen公司） 提取44例标本的总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。符合要求的标准：OD260/OD280在1.8～2.0；电泳显示28 S/18 S约为2，5 S很弱或没有。采用Quant Reverse transcriptase （天根生化科技） 将RNA逆转录成cDNA。PCR反应分别扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 和BAI1片段，反应结束后行1.5%琼脂糖凝胶电泳，对电泳结果进行图像分析 （天能GIS1000数码凝胶图像分析系统），记录每个条带的灰度值，将实验组灰度值和与之相对应的内参照组灰度相比，将比值作为BAI1相对表达水平的参数。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列: BAI1上游引物：5'-CCGCTGTGTTTCCATTGACTA-3'，下游引物：5'-ACCACAAACACGGATGCTTCA-3'，扩增片段大小为564 bp；GAPDH 上游引物：5'-CATCCATGACAACTTTGGTATC-3'，下游引物：5'-CCAT CACGCCACAGTTTC-3'，扩增片段大小为100 bp。PCR条件为95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，BAI1 28循环，GAPDH 26循环；72 ℃ 10 min。

    1.3    统计学分析    各组BAI1 mRNA表达水平的相对灰度值以x ± s表示，采用SPSS11.5统计软件进行方差分析，以P ＜0.05为差异具有统计学意义。

    2    结    果

    BAI1 mRNA在6例 （100%） 对照组脑组织和26例 （68.4%） 胶质瘤中表达。相对灰度值分别为：对照组0.870 ± 0.140，Ⅱ级0.213 ± 0.078，Ⅲ级0.266 ± 0.087，Ⅳ级0.151 ± 0.073。4组间BAI1基因转录表达水平差异有统计学意义，F ＝ 9.378，P ＝ 0.000；对照组高于Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤、Ⅳ级胶质瘤组，均P ＝ 0.000；各胶质瘤组间差异无统计学意义 （图1，2）。

    3    讨    论

    　　      近年来，抑制肿瘤血管生成的基因治疗日益受到重视。促血管生成因素与血管生成抑制因素间的平衡是新生血管是否形成的决定因素；向肿瘤细胞转染血管生成抑制因子基因，增加其在肿瘤局部的表达，有利于使这种平衡向抑制血管生成的方面倾斜，达到抑制肿瘤生长的目的。血管生成抑制因子包括血小板凝血酶敏感蛋白1 （TSP1）、血管抑素、内皮抑素、血小板4因子 （PF4）、胶质瘤源性血管生成抑制因子 （GD-AIF） 和BAI1等。

BAI1的胞外区含有5个TSP1重复序列，可抑制由碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 诱导的血管增生反应[1]，其特异性在脑组织中表达，Northern杂交显示：在胚胎和成人脑中皆有表达，但其mRNA的亚区在不同的解剖区域呈不均匀分布。BAI1 mRNA的表达水平在大脑皮质最高，小脑、尾状核、壳核、杏仁核、海马次之，髓质、黑质、下丘脑核、丘脑表达最弱，而胼胝体和脊髓组织中无表达[3]。这与特异性在神经元和神经内分泌细胞中表达的神经元特异性烯醇化酶 （NSE） 的表达形式类似[4]，而与特异性在星形胶质细胞中表达的胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 的表达形式明显不同[5]。说明BAI1 mRNA主要在神经元而不是星形胶质细胞中转录表达。Nam等[2]发现：BAI1 mRNA仅在26 例GBM中的9例和全部5例良性胶质瘤中表达；Kaur等[6]对28个GBM细胞系的研究结果也显示：多数BAI1 mRNA表达缺失，但在8个细胞系中仍然发现了BAI1 mRNA。

    本研究检测了BAI1 mRNA在对照组脑组织和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中表达的情况，结果显示：对照组脑组织均有BAI1表达，12例Ⅱ级胶质瘤中BAI1表达缺失5例，12例Ⅲ级胶质瘤中BAI1表达缺失2例，14例Ⅳ级胶质瘤中BAI1表达缺失5例。BAI1 mRNA在胶质瘤标本的表达阳性率为68.4%，与BAI1 mRNA在肺癌的表达 （79.2%）[7]类似。胶质瘤BAI1基因的转录表达水平显著性低于对照组脑组织，说明BAI1可能在胶质瘤的发展中起促进作用。令人难以理解的是，BAI1 mRNA在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤的表达水平没有统计学差异。高级别胶质瘤比低级别胶质瘤的血管密度明显增加，且Dunn等[8]证实：在血管增生过程中具有重要作用的促血管生长因子 （VEGF） 表达显著增加，据此推断，BAI1 mRNA的表达水平应该与胶质瘤的级别呈负相关。但本研究结果却与此推断不符，考虑原因可能有以下两点：①部分胶质瘤虽有BAI1 mRNA表达，但是不能翻译成BAI1蛋白。基因是通过其最终表达产物——蛋白质来发挥作用的，而Kaur等[6]发现：在8个有BAI1 mRNA转录表达的GBM细胞系中检测不到BAI1蛋白，说明BAI1可能进行了转录后调节，使蛋白表达缺失或表达水平很低。目前尚缺乏肿瘤实体内的类似报道，仍需进一步证实。②部分胶质瘤有BAI mRNA表达并且翻译成BAI1蛋白，但是在脑肿瘤复杂的病理生理环境下，促血管生成因素和血管生成抑制因素间的平衡可被不同的方式打破，BAI1抑制血管生成的作用可能被肿瘤内其他因子所克服。使得BAI1最终不能发挥抑制血管增生的作用，BAI1阳性细胞仍发展成为GBM，使得BAI1蛋白阳性和阴性GBM的血管密度并没有显著性差异[6]。这与结直肠癌、肺癌不同，Hatanaka等[7]和Fukushima等[9]分别发现：结、直肠癌和肺癌中BAI1基因的表达水平与肿瘤内血管密度呈负相关。

    本研究证实：BAI1 mRNA在部分胶质瘤中表达缺失，可能对胶质瘤的发生、发展具有促进作用。因此，BAI1可能成为脑胶质瘤基因治疗的新靶点。目前，此类研究已经开展并取得了初步成果。直接脂质转导BAI1胞外段基因到兔模型的角膜，有效抑制了角膜新生血管的生成[10]。Kang等[11]和肖新如等[12]的研究表明：转染编码BAI1腺病毒载体的GBM细胞系在mRNA和蛋白水平均有BAI1表达；小鼠脑内接种GBM细胞系U87MG，肿瘤形成后在瘤内注射BAI1重组腺病毒，肿瘤生长明显受到抑制，形态学上出现肿瘤广泛性坏死、瘤内血管密度降低等变化。这说明BAI1可作为胶质瘤，尤其是GBM基因疗法的候选基因。

    　 综上所述，BAI1在部分胶质瘤中表达缺失，但缺失的机制仍需进一步阐明。BAI1具有强烈抑制血管生成的作用，因此有望成为胶质瘤基因治疗的选择之一。

【参考文献】  [1] NISHIMORI H, SHIRATSUCHI T, URANO T, et al. A novel brain-specific p53-target gene, BAI1, containing thrombospondin type 1 repeats inhibits experimental angiogenesis [J]. Oncogene, 1997, 15(18): 2145-2150.

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