神经胶质瘤基因治疗新位点的应用

作者                                作者单位

金日华                 吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021

朴莲花                 日本国立佐贺大学生体构造机能学研究室

RNA干扰 (RNAi) 是一种新发现的通过dsRNA介导的特异同源靶基因途径[1]。自从1998年发现以来[2]，就以其独特的优势在功能基因组学研究中迅速占有一席之地，迄今已成为基因研究中不可或缺的工具之一，并且随着对其作用机制的逐步了解和应用技术的日渐成熟，已开始应用于疾病防治等多个方面，同时RNAi技术的出现为胶质瘤基因治疗的研究提供了新的策略。在研究过程中，不断有新的可用于RNAi治疗脑胶质瘤的靶标基因被发现，其治疗作用主要通过抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤细胞周期阻滞或增加肿瘤细胞化疗敏感性。

1 RNAi在神经胶质瘤治疗中的应用

癌症是一种基因组的病症，其特征为原癌基因的激活和抑癌基因的失活，至今已经发现了数百种原癌基因。原癌基因可以编码的蛋白主要包括生长因子及其受体、信号转导通路蛋白分子、基因转录调节因子和细胞周期调控蛋白等几大类。如果将与翻译这些蛋白的mRNA相关的siRNA制成一种基因序列特异性的药物转入到肿瘤细胞中，通过RNAi作用降解原癌基因所转录的mRNA，就能关闭肿瘤相关基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。而对于抑癌基因的失活，由于主要是抑癌基因的突变导致其与正常抑癌基因有一定差别，所以可以利用RNAi技术，针对突变基因转录的mRNA设计出相关的siRNA，而消灭其mRNA，从而阻止突变基因的表达，同时并不影响正常抑癌基因的作用，从而达到治疗癌症的目的。

2 神经胶质瘤基因治疗的新位点

2.1 原癌基因：原癌基因是细胞基因组内正常的组成成分，自然状态下无致癌作用，其主要作用是通过编码生长因子等调节正常细胞的生长、分化。原癌基因激活是肿瘤发生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成为目前研究肿瘤治疗的热点之一。

原癌基因c-myc：c-myc基因是一种控制细胞增殖和分化的原癌基因，具有调节细胞增殖和凋亡的双重作用。c-myc高表达使细胞具有高度增生潜能，同时还抑制细胞的分化。在脑胶质瘤中存在c-myc mRNA异常过量表达，c-myc基因表达异常增加与胶质瘤的发生、发展密切相关，其表达水平也是评价胶质瘤生物学行为和患者预后有价值的参考指标[3-4]。 Wang等研究证明，通过慢病毒载体转染shRNA干扰作用进行调控，敲除脑胶质瘤细胞中c-myc基因降低细胞增殖，并使其终止于G0/G1期，调节细胞凋亡作用[5]。

S期激酶相关蛋白2(Skp2)：Skp2是泛素连接酶复合物的底物识别序列，对正常细胞周期调控起重要作用。一些研究表明Skp2具有原癌基因的潜能，在人类多种恶性肿瘤中过度表达，与肿瘤的发生、发展及预后关系密切[6-7]。在人类肿瘤的研究中发现，Skp2在多种肿瘤中呈高表达，如结直肠癌、宫颈癌、口腔鳞状细胞癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤等，并发现Skp2表达水平高低与肿瘤的恶性程度及预后有关[8]。泛素-蛋白酶体途径是许多细胞周期调节物降解的重要途径，该途径需要泛素连接酶E3的参与。E3是一种多蛋白复合物，由Skp1、Cullin1、Roc1/Rbx1和一种F-box蛋白组成。F-box蛋白是该复合物的底物识别亚单位，而Skp2正是F-box蛋白家族成员之一，Skp2可以促进癌基因c-myc诱导的S期转换，激活c-myc靶基因，并与c-myc共同参与肿瘤的形成与增殖[9]。因此，Skp2基因被认为是一种原癌基因，Skp2蛋白能促进细胞通过G1-S转换“关卡”，从而促进细胞周期的进展、DNA的复制以及细胞的增殖，而且Skp2表达水平的改变可能是多种癌基因、抑癌基因的致癌途径之一。

垂体瘤转化基因(PTTG)：PTTG作为原癌基因，在神经胶质瘤中呈过度表达，通过RNAi作用降低PTTG，显示出肿瘤细胞的增殖受到抑制。作为一个新的原癌基因，与凋亡关系的研究相对较少。YU研究发现，PTTG过度表达能够诱导细胞凋亡，并且上调p53的凋亡诱导作用，而p53的过度表达也能促进PTTG诱导凋亡，PTTG具有诱导凋亡作用[10]。徐松柏等研究证明PTTG siRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U251细胞PTTG基因的表达，从而调控肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖[11]。

2.2 抑癌基因：由于抑癌基因在细胞增殖调控中起重要作用，因此，也成为基因治疗的重要目标之一。p53基因是最早利用RNAi技术研究的基因之一，人体内大约50%肿瘤的发生是p53基因突变的结果。p53基因能够抑制DNA合成及诱导DNA修复来抑制细胞生长，使细胞停滞在G1期。突变型p53失去对细胞增殖的负调控作用，导致细胞增殖失控发生癌变。Martinez等的报道中，将H1299细胞转染野生型p53和突变型p53的RNA表达型质粒，结果野生型siRNA明显抑制野生型p53蛋白的表达，对突变型几乎无效，而突变型siRNA显著抑制突变型p53蛋白表达，野生型基因则不受影响。由此证明，RNA序列能特异性地分别抑制上述两种基因的表达，并且对突变型p53的抑制可在一定程度上恢复野生型基因的表达和功能[12]。为此为选择性和个体化治疗肿瘤提供了可能。

2.3 其他相关基因：hTERT 基因：RNAi能抑制体外培养的U251细胞hTERT mRNA及其蛋白表达，从而抑制端粒酶活性，进而抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。有研究证明，根据hTERT 的cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的shRNA真核表达质粒pshRNA，将pshRNA通过脂质体包裹的方法转染入荷瘤裸鼠瘤体内，观察RNA干扰hTERT基因抑制肿瘤生长的效果。结果证实：给予shRNA质粒后，肿瘤的生长受到明显抑制，治疗结束时hTERT shRNA组肿瘤体积较PBS组和空质粒组明显减小，抑瘤率为58.2%，说明RNAi治疗脑胶质瘤时能有效抑制肿瘤增殖[13]。

Survivin 基因：Survivin基因是凋亡蛋白抑制因子(IAP)家族中的一个新成员，它在包括胶质瘤在内的人类多种类型的恶性肿瘤中存在高表达，而在成人的正常组织中无表达或仅有低表达，因此，近年来成为颇受注目的肿瘤治疗靶点之一。研究人员采用RNAi技术，构建了针对人Survivin基因的特异性shRNA真核表达载体，并证实稳定转染该表达载体可明显抑制人脑胶质母细胞瘤U251细胞Survivin基因mRNA和蛋白表达，进而显著抑制U251细胞的体外生长和诱导瘤细胞发生大量细胞凋亡。靶向Survivin基因的shRNA能够在体内明显抑制U251细胞的肿瘤生长和血管形成，Survivin基因可作为脑胶质瘤基因治疗的良好靶点，而RNAi技术可为脑胶质瘤的基因治疗提供新的重要手段。

Notch 1基因：近年来Notch信号在胶质瘤增殖存活中的作用日益受到关注。Notch 1既具有促癌作用，也具有抑癌作用。purow等通过RNAi技术使Notch1 shRNA转染给所有6种人脑胶质瘤细胞系，使用流式细胞术和细胞周期分析显示胶质瘤细胞显著凋亡和增殖抑制[14]。结合purow的实验结果，可以推断notch1对人脑胶质瘤的发生和发展是起促进作用的。 Notch l基因 RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长的作用，Notch1可作为基因治疗胶质瘤优选靶点之一，RNA干扰Notch1治疗恶性胶质瘤在临床具有潜在的应用前景。

3 问题与展望

RNAi是近年来发现的一种古老而保守的生物途径，是生物体适应外界环境、调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的重要机制，具有重大的生物学意义。目前世界上肿瘤基因治疗虽然是基因治疗研究的热点，但是基因治疗作为肿瘤治疗手段尚不成熟。①如何在体内实现靶基因RNA转移到所有肿瘤细胞并稳定持久地抑制癌基因表达;②如何确定21～23 nt左右的核甘酸序列作为siRNA模板的选择原则;③如何提高载体系统的效率等。总之，RNAi技术作为一种研究的新工具、治疗的新手段，随着对其机制的不断认识和技术的改进，必将在肿瘤的研究及治疗中担任不可替代的角色，同时也预示在后基因组时代里一个崭新的RNA时代的到来。

【参考文献】

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