视网膜母细胞瘤结合蛋白-6在结肠癌组织中的表达及其意义

结肠癌目前最为有效的治疗措施为手术切除，肿瘤复发是导致结肠癌患者术后治愈率下降的主要原因，严重影响患者的生活质量，且一部分患者死亡率也随之升高。因此，发现并应用新的预测肿瘤复发的因子对实施个体化、导向性的治疗尤为重要。新发现的癌基因视网膜母细胞瘤结合蛋白一6(RBBP6)在肺癌·和食管癌中高表达，但却缺少其在结肠癌中表达的报道。本实验旨在观察RBBP6基因在结肠癌组织中的表达，探讨其对结肠癌发生、发展的意义。　　材料与方法　　1.一般资料:40例结肠癌患者中女23例(57.5%)，男17例(42.5%);年龄(68.45土10.47)岁。所有标本均为上海交通大学附属上海市第一人民医院普外科恶性肿瘤患者的手术切除标本。经病理确诊为结肠癌。其中I期患者5例(12.5%),II期患者15例(37.5%)，111期患者17例(42.5%),1}1期患者3例(7.50}o);细胞分化较好12例(30%)，分化一般的19例(47.5%)，分化较差的9例(22.5%;有淋巴结转移8例(20%)，无淋巴结转移的32例(80%0)所有病例均达到肉眼下根治，并行术野的淋巴结清扫。　　术后切下标本后，即刻于肿瘤及瘤外5cm以上区域(作为无瘤组织)分别切取1块1c而左右大小组织块，立即置人一196℃液氮中保存。所有病例术前均未行放、化疗等抗肿瘤治疗。将所有病例按年龄、性别、肿瘤分布、大小、分期、分化、淋巴结有否转移等进行分组二以实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)法检测RBBP6在肿瘤组织和正常组织(癌旁无瘤组织)中的表达。RNeasyProtectMini试剂盒(德国(}ia-ben公司)用于RNA提取，逆转录试剂盒(2uantiTect.　　ReverseTranscription(美国Fermenta、公司)，PCR试剂盒MaximaSYBRGreenc1PCRMasterMixes(美国Fer_mentas公司)。免疫组织化学抗体:鼠抗人RBBP6单克隆抗体(ab55787，美国Abeam公司)，即用型二抗GTvision抗鼠/兔通用型(基因科技G1}500705)仪器:匀浆器，Fppendorf荧光定量PCR仪，凝胶显影仪。　　2.RNA提取:每30mg组织加人600plRTL试剂，在匀浆器中将组织块磨成匀浆，使样品充分裂解，移人离心管。将离心管在4℃,12000r/min，离心10min，吸出_[清，加人另一离心管中，同时加人等体积的70%乙醇，用吸管混匀。吸取700闪的样品加人附有RNeasy吸附柱的2ml收集管中，40C,12000r/mir，离心1min,弃废液。加人700闪R}}1缓冲液至吸附柱，40C,12000r/min再次离心1min，冲洗吸附柱，弃废液。加人500p,1RPE试剂至吸附柱，40C,12000r/min离心1min，弃废液。重复上一步骤2次。转移吸附柱至新的2ml离心管，离心再将吸附柱转移至新的1.5ml收集管中，加人30一50闪的无核糖核酸酶水，洗脱吸附柱土的RNA,40C,12000r/min离心2miry，收集管中即得提取的RNA。用紫外分光光度讨一检测RNA在260nm处的吸光度(A)值，A二20m郭L。根据在260nm和280nm处的A值，检测RNA的纯度。　　3.cDNA合成及Real-timePCR:通过逆转录反应以Oligo(dT)15为引物，由totalRNA的3'Poly(A)区域引导出eDNA，而后以eDNA产物为模版，设计并合成PCR引物(表1)，在Eppendorf高通量荧光定量PCR仪进行Real-timePCR反应。PCR反应条件:500C2min,950C10min，95℃15s，600C30s，720C30s，共进行40个循环后72℃延伸5min。测得RBBP6和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDR)的表达。反应完成后，取部分反应液点于1.8%琼脂糖凝胶中，70V电泳。　　4.Real-timePCR结果校正:40对样品量均为1闪，然而由于受RNA浓度的定量误差和P1NA转录效率误差等影响，每个样品1闪体积中的eDN,A含量并不相同，为校正此差异，木研究使用管家基因GAPDH作为内参，以样品待测基因值与此样品内参值经公式换算后即得2-}}c:}:RBBp6L1Ct=(Avg.RBBP6_Ct一Avg.CF'DH_Ct)，RBBP6}OCt=(RRBP60Ct_tumor-RBBP6'Ci_non-tumor)。　　5.免疫组织化学法:将存档的72对石蜡标本重新制备厚4htm切片，脱蜡，再水化。置于pH6.0的柠檬酸缓冲液中行高压抗原修复后，3aloHzOz封闭内源性过氧化物酶活性~滴力[}IRRBP6一抗，4℃冰箱湿盒内孵育过夜。滴加二抗，并置于37℃恒温箱内孵育30rain一显微镜下二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水至透明，中性树胶封片。用已知结肠癌切片作为对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。结果判定:由2位不知晓患者临床资料的病理医师进行结果判定。以胞核内有黄或棕黄色颗粒染色者为RBBP6阳性细胞，阳性细胞占百分比<10%记为阴性，10%一50%者为弱阳性，>50%者为强阳性、6.统计学方法:应用SPSS19.0统计软件分析，计量资料统计一中多组之间采用厂检验和Fisher精确检验结果1.RNA抽提质量鉴定:经鉴定，最终所有样本RNA在丸wAzs。的比值均在1.8一2.0，表明提取的RNA无降解及蛋白质污染。　　2.Real-timePCR检测40对样本RBBP6mRNA的表达:肿瘤组织中RBRP6mRNA的表达平均值为4.88，远高于正常结肠组织(距病灶5cm以上无癌瘤处组织)中RRBP6mRNA的表达平均值(3.49,P<0.01)。进一步比较RBBP6mRNA在肿瘤组织中的表达，可见RBBP6mRNA的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小无明显相关(P>0.05);而在结肠癌不同分期类型}}}}I期和11期RBBP6mRNA的表达量为4.31士0.74,}和W表达量为5.45士1.49，可见分期越晚，RBBP6mRNA表达越高(P<0.05)。并且RBBP6mRNA的表达在淋巴结有转移者为5.07士1.37，高于淋巴结无转移者4.42士0.68P<0.05)。部分特异性PLR扩增产物凝胶电泳结果显示正常组织和肿瘤组织cDNA量的差异有统计学意义，肿瘤组扩增量显著增加(P<0.05，图1)。　　3.RBBP6表达与临床病理资料的关系:结果见表2_RBBP6的表达量与区域淋巴结转移(P<0.05、肿瘤远处转移(P<0.01)、肿瘤分期(I'<0.01)和分化(P<0.05)高度相关，而与年龄、性别、肿瘤大小无明显相关(P>0.05)072例结肠癌肿瘤组织中RBBP6阴性者23例，弱阳性者32例，强阳性者17例。免疫组织化学染色显示RBBP6在正常组织无表达或弱表达6.9%(5/72)，在肿瘤组织中高表达68.1%(49/72)，与RT-PCR检测结果一致(图2).　　讨论　　基因RBBP6位于16p11.2一p12，编码200000的蛋白。RBBP6是1种核蛋白，其N端有锌指结构域，可通过人双微体蛋白2(HDl}Z2)降解p53，提示其有E4样泛素化样活性!SJ我们应用结肠癌新鲜冰冻标本检测F}BBP6mRNA表达水平，可见其在肿瘤组织的mRNA水平显著高于正常结肠组织(4.88比3.49)进一步免疫组织化学显示68.1%(49/72)的结肠癌组织表达RBBP6，正常组织中只有6.9%(5/72)这些结果提示RBBP6在转录和转录后水平都是高表达。进一步分析显示RBBP6的表达量与区域淋巴结转移、肿瘤远处转移、肿瘤分期和分化高度相关，而与年龄、性别、肿瘤大小无明显相关。它提示RBBP6高表达会促进肿瘤的侵袭和转移。在结肠癌不同分期类型中，I期和11期RBBP6mRNA的表达值为4.31士0.74,III期和IV期表达值为5.4511.49，可见分期越晚，RBBP6mRNA表达越高，提示其有促进结肠癌发展的作用。结合免疫组织化学、PCR的结果以及联合临床病理参数相关性分析结果，提TRBBP6可作为结肠癌诊断及判断预后的新指标二RBBP6在肺癌中高表达，在肺癌细胞转染p53siRNA会增加RBBP6ruRNA的表达。转染RBBP6siRNA会提高bax/B细胞淋巴瘤/自血病一2(bcl-2mRNA的表达，提示RRBP6有抑制肺癌细胞凋亡的作用P3}在食管癌的研究中也现RBBI'6高表达川RBBP6已被证实可与抑癌基因p53'}6〕和Rb}'}结合，有抑制p53结合DNAr一以及抑制腺病毒一早期基因(ElA)结合Rb}-w}的功能，提示其有促肿瘤形成的作用。RBBP6过表达会导致细胞周期停滞，提示其有抑制细胞正常生长的功能。　　(本文图2见封三)　　参考文献　　汪建平,兰平. 结直肠外科临床与基础研究展望[J].中华实验外科杂志,2006,(7):776-778.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2006.07.002.　　郁宝铭. 胃肠道肿瘤分子生物学研究的发展方向[J].中华实验外科杂志,2005,(10):1162-1163.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2005.10.003.　　Lesetja RM,Kanti DB,Zodwa D. Expression and function of retinoblastoma binding protein 6(RBBP6)in human lung cancer[J].Immunobiology,2011.1065-1073.　　Yoshitake Y,Nakatsura T,Monji M. Proliferation potential-related protein,an ideal esophageal cancer antigen for immunotherapy,identified using complementary DNA microarray analysis[J].Clinical Cancer Research,2004.6437-6448.　　Mautin AK,Eiso AB,Faqeer H. Solution structure of RING finger-like domain of retinoblastoma-binding protein-6(RBBP6)suggests it functions as a U-box[J].Journal of Biological Chemistry,2012.7146-7158.　　Simons A,Melamed AB,Wolkowicz R. PACT:cloning and characterization of a cellular p53 binding protein that interacts with Rb[J].Oncogene,1997.145-155.　　Sakai Y,Saijo M,Coelhob K. cDNA sequence and chromosomal localization of a novel human protein,RBQ-1 (RBBP6),that binds to the retinoblastoma gene product[J].Genomics,1995.98-101.