基因突变检测在胃肠间质瘤诊断和治疗中的应用及其价值

　　早在20世纪80年代，胃肠间质瘤(gastrointestinalstromaltumor,GIST)这一概念就已经被提出。但是直到1998年，Hirota等〔’一发现了GIST特征性地表达KIT蛋白(CD117)并存在c-kit基因的功能获得性突变，这一疾病才真正被人们认识和重视。2003年，Heinrich等rz发现部分缺乏c-kit基因突变的GIST中存在血小板源性生长因子受体。(platelet-derivedgrowthfactorreceptoralpha,PDGFRa)的突变，这一发现进一步完善了GIST的发病机制。-kit与PDGFR。基因均编码跨膜酪氨酸激酶受体，在生理情况下，与配体干细胞因子(stemcellfactor,SCF)结合后，触发下游的信号转导级联，调节重要的细胞功能。突变的KIT/PDGFRA可以不依赖配体而自动磷酸化，进而持续激活导致肿瘤发生。c-kit与PDGFRa基因的突变状态不仅对于确立GIST诊断有重要意义.更与靶向药物治疗反应、甚至可能与疾病预后有关因此对于上述基因突变的检测，已经成为GIST研究领域的热点之一川of床上也越来越重视这一工作。　　一、重视并合理开展基因突变检测　　无论是国外的G工ST诊疗指南还是国内的GIST诊疗专家共识均强调了基因突变检测在(GIST诊断中的重要性’5以国内专家共识为例，推荐存在以下情况时，进行基因突变检测;(1)听有初次诊断的复发和转移性GIST，拟行分子靶向治疗;(2)中高度复发风险GIST手术后，拟行伊马替尼辅助治疗;(3)疑难病例;(4)鉴别NF1型GIST、完全性或不完全性Cameo联症、家族性GIST以及儿童GIST;(5)鉴别同时性和异时性多原发GISTo随着分子生物学技术的迅速发展，可用于基因突变检测的手段也越来越多，如DNA测序法、单链构象多态性分析法(SSCP)、变性高效液相色谱分析法(DHPLC)和高分辨率熔解曲线法(HRM)等，但是为了保证检测结果的准确性，目前大多数实验室还是采取反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)扩增加直接测序法需要首先设计合理的引物扩增出目的片段(不同外显子)，再通过PCR扩增出目的产物，进行纯化测序，有突变者宜通过反向测序加以证实根据GIST中c-kit/PDGFR。基因突变发生的规律，常规的检测位点应至少包括c-kit基因的第9,11,13,17外显子及PDGFR。基因第12和18外显子。　　随着临床上对GIST认识的提高，对于一些从前手术后诊断为“平滑肌肉瘤”而术后多年出现复发再次就诊的病例，临床医师往往会考虑到GIST的可能。为了证实GIST诊断，需要进行切片复习甚至进行基因突变检测，这时可能会遇到的问题是:多年之前的蜡块组织能否进行基因突变检测笔者曾收治多例类似病例，其中部分基层医院病理科保存的5年以上的蜡块已经很难提取出足够丰度的DNA用于测序，而长期(6--10年)保存的最后测序成功的蜡块均来自三甲医院。也有文献报道，保存18年甚至30年的蜡块组织也可成功测序。可见病理组织包埋固定技术及保存条件对于基因突变检测有很大影响，需要临床上加以重视。　　二、合理应用基因突变检测以甄别“真假"GIST10余年来，GI}T的病理诊断经历了一个逐渐丰富的过程，从早期的免疫组织化学(免疫组化)标志物CD34到后来的CD117，再到近年来新发现的DOG1，诊断GIST的敏感性和特异性不断增加。虽然从发病机制上来看，CD117阳性应该是GIST的重要特征，但是临床上也会遇到CD117阴性甚至DOG1也阴性的GIST。造成GIST中CD117阴性的原因包括:(1)野生型GIST;(2)PDGFR。高表达;(3)组织固定不理想;(4)抗体效价低等7。对于这部分病例，国内GIST诊疗专家共识明确指出:即使肿瘤形态学上符合GIST表现，也应由专业的分子生物学实验室进行〔-kit/PDGFR。基因突变的检测，如果检测发现存在上述基因突变，GIST诊断可以成立s。根据笔者所在单位对200余例GIST的基因突变检测结果，CD117呈阴性或仅呈可疑阳性的病例接近10%，其中存在。-kit基因突变、PDGFR。基因突变和野生型者均各占约1/3，因此，仅根据CD117阳性表达来诊断GIST是不合理的，结合基因突变检测才能避免漏诊那部分CD117{拥性的GISTo毋庸置疑，随着GIST概念的逐步建立和明确大部分从前诊断平滑肌瘤、平滑肌肉瘤和神经纤维瘤等其他间叶来源的肿瘤实际上都应归于GIST。然而，在观念更新的同时，要避免纠枉过正，即过分放宽GIST的诊断标准国内专家共识指出:对于组织学形态符合GIST，但CD117/DOGI阴性、基因检测也阴性的病例，在排除平滑肌肿瘤、神经源性肿瘤后，可以做出GIST可能的诊断5这实际上要求病理科医师要具有丰富的经验，能够在纷繁复杂的间叶源性肿瘤中进行客观的鉴别诊断。如果将一例非GIST的间叶源性肿瘤诊断为GIST，将可能误导临床治疗策略的选择、以笔者单位为例，对近20例疑似GIST,但CD117阴性、基因突变检测也阴性的病例，经过多名高年资病理科医师反复阅片，鉴别出多种其他间叶源性肿瘤(包括平滑肌瘤和平滑肌肉瘤、神经纤维和神经鞘膜瘤、多形性未分化肉瘤、隆突性皮纤维肉瘤、副神经节细胞瘤等)，最终仅5例给出“不排除野生型GIST”的诊断可见，在临床上对于给出“CD117阴性的野生型GIST"这类较为明确的诊断要慎重。　　三、利用基因突变分析指导靶间治疗策略　　c-kit基因通过不同外显子编码相应结构域，如11外显子编码细胞内膜旁结构域，9外显子编码细胞外跨膜结构域靶向药物甲磺酸伊马替尼治疗(GIST的机制在于，其可与KIT蛋白的激酶结构域结合发挥作用，c-kit基因11外显子哭变导致相应编码结构域的改变，对伊马替尼结合的影响很小，因此，11外显子突变的GIST对常规剂量(400mg/d)伊马替尼治疗的反应最好si^外显子突变的GIST对伊马替尼反应要较11外显子突变为差，但是研究已经证明，通过加大伊马替尼治疗剂量至800mg/d国内推荐600mg/d)可以使这部分病例获益9。对于c-klt基因其他外显子突变和野生型患者应用伊马替尼靶向治疗的效果，由于发病率低，目前还没有令人信服的数据报道，但是值得注意的是，野生型GIST如果为合并I型神经纤维瘤者，对伊马替尼治疗无效，应当避免应用GIST中PDGFR。基因最常见的突变形式是D842V，这是一种已知在体内外对伊马替尼均原发耐药的突变一‘。。这是临床上对GIST患者进行伊马替尼治疗之前要进行基因突变检测的一个主要原因。通过基因突变检测筛除这部分伊马替尼治疗无效的患者，一方面避免了患者不必要的负担，另一方面也避免了医疗资源的浪费。值得一提的是，PDGFR。基因D842V突变多发生于胃，预后普遍良好m。笔者收治过2例巨大(超过10cm)胃GIST患者，术后基因突变检测为PDGFR。基因D842}`突变，予以随访至今，1例超过2年，另1例超过4年，均未见复发转移可见对这部分患者采取随访的治疗策略还是安全的。　　伊马替尼治疗中出现的疾病进展是始终困扰临床医师的问题，在接受伊马替尼治疗1-3年后，有50%}70%的患者可能出现疾病进展1互大量研究已经证实.c-kit基因的继发突变是导致伊马替尼耐药的主要原因。继发突变往往是在原有突变的基础仁出现新的位点的突变。如c-kit基因第13和17外显子的突变可以改变KIT蛋白的第一和第二个激酶结构域.影咽伊马替尼的结合.导致耐药的发生1斗15其他少见的突变类型如。-kit基因14外显子的T670突变，通过改变人丁P结合域的苏氨酸(看门氨基酸)，进而影响伊马替尼的结合一苹果酸舒尼替尼是伊马替尼治疗失败的首选二线治疗药物’s一包括c-kit基因9外显子突变GIST,野生型GIST和存在V654.A及T670I的继发突变GIST在内的多种GISI-亚型有可能从舒尼替尼治疗中获益‘y-z。但是，随着应用的增加，越来越多的舒尼替尼耐药被报道井加以研究r-kit基因D816和D860位点的突变导致的酶自身活化可能是纤尼替尼耐药的原因之一u}z临沐医师在遇到靶向治疗过程中疾病进展的病例时，应当合理利用基因突变检测进行原因分析:是出现了继发突变导致耐药?还是血药浓度低于阂值导致治疗效果不佳?　　或是其他原因导致?对于多病灶的进展期(GIST，如果部分病灶出现继发突变.但主要病灶仍为原发突变类}!J，那么在切除大部分继发突变病灶(耐药克隆)后，即使原发突变病灶无法根除，使用靶向药物治疗还是有可能使患者获得满意的疾病稳定时间四、基因突变检测对在LIST预后评估中的价值目前，临床上多采用2008年更新版的}IH危险度分级标准对GIS"I'进行预后评估「z3。根据这一标准，肿瘤直径大于10cm、核分裂像超过5/50HPF和非胃起源及肿瘤破裂是GIST预后不良的影响因素。然而，GIST生物学行为多样，部分患者的预后难以用上述标准解释。近年来，国内外大量的研究者试图寻找c-kit/PDGFR。基因突变特征与GIST预后的关系。早期的研究大多认为，存在。-kit基因11外显子突变的GIST患者预后要差于c-kit基因11外显子野生型的GIST}2'七c-kit基因9外显子突变的GIST集中发生于小肠，预后较差}u-'}oSinger等[m7认为，突变类型也可能对GIST预后有影响，他们的研究发现，存在c-kit基因删失/插人突变的GIST患者预后要差于错义突变的GISToMartin-Brot。等「巩对162例GIST的基因突变研究显示，c-kit基因557/558号密码子删失突变的GIST有较高的术后复发或转移率。　　Wozniak等}z}}的研究同样发现，c-kit基因11外显子557/558删失突变的GIST患者预后要显著差于PDGFRa突变或c-kit基因11外显子突变者Lasota等处对1000例GIST中PDGFRa基因突变分析的结果显示，PDGFRA基因突变主要形式为18外显子突变，多发生于胃GIST,巨核分裂像计一数普遍较低，预后较好。他们的后续研究还发现，部分GIST存在PDGFR。基因14外显子的突变，该突变形式同样集中于胃GIST，形态学上以上皮样细胞为主，具有良胜生物学行为ii。　　然而，也有其他研究认为，c-kit或PDGFR。基因的突变状态并非是GIST患者术后生存的独立影响因素犯国内学者对于基因突变在GIST预后评估上的作用也展开了一定研究李超亿等〔33发现，突变型GIST的预后优于野生型GIST但基因突变并非预后的独立影响因素。可见，c-kit/PDGFR。基因突变与GIST预后之间的联系还有待进一步的研究证实随着现代外科理念的更新，多学科综合的规范化诊治和个体化治疗已成为GIST诊疗的主流和必然趋势在诊治GIST的过程中，临床医师必须认识到基因突变检测的价值并加以合理应用，才能够达到提高GIST诊疗效果的目的。　　参考文献　　Hirota S,Isozaki K,Moriyama Y. 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