葡萄糖载体-1在脑出血患者血-脑屏障内皮细胞中的表达研究

　　作者：张熙泉 张微微 黄勇华 田玉旺

　　作者单位:063700河北唐山滦县人民医院神经内科　　100700北京北京军区总医院神经内科神经病理学实验室

　　【摘要】 目的 探讨血-脑屏障(BBB)中葡萄糖载体-1(55kDa Glut-1)在高血压性脑出血(HIH)病理进程中表达水平的变化规律及其发病关系。 方法 人脑组织标本来自15例尸检HIH患者和7例非神经系统疾病死亡的尸检作为对照。应用免疫组化方法(兔抗人的Glut-1抗体、鼠抗人的GFAP抗体)进行标记，分析脑出血4～18h、24～32h、72h后的脑BBB毛细血管内皮细胞中Glut-1蛋白表达水平的变化规律。同时，采用多媒体彩色病理图文系统(MPIAS-500)计算脑BBB-Glut-1的平均灰度(AGD，0～255)和平均光密度(ALD)。 结果 对照组55kDa Glut-1在脑微血管(主要是BBB毛细血管)内皮细胞特异性表达，显示清晰完整的内皮细胞边界。其AGD、ALD均值分别是188.83±4.95和0.129±0.014。HIH组，Glut-1蛋白在出血病灶周围脑微血管内皮细胞的表达水平在4～18h组开始应激性增高，在24～32h组至高峰(其AGD、ALD均值分别是156.49±10.37和0.220±0.042)，其中AGD显著低于对照组17.12%(P<0.001)，ALD显著高于对照组70.54%(P<0.001)。HIH72h之后组，脑组织广泛水肿、坏死，BBB破坏，55kDa Glut-1的表达已经明显下降低于对照组。 结论 BBB-Glut-1(55kDa)作为研究BBB组织特异性基因表达的模型，在HIH患者脑组织中Glut-1即早应激性表达增加。证实了Glut-1基因在环境应激状态下具有诱导反应的特性，为充分保障脑的葡萄糖供应和正常维持脑的能量代谢稳态提供了一种重要的防御调控机制。

　　关键词 葡萄糖载体-1 血-脑屏障 高血压性脑出血 免疫组织化学

　　Study on the expression of glucose carrier protein1in endothelial cell of blood-brain barrier in hypertensive intracerebral hemorrhage

　　Zhang Xiquan，Zhang Weiwei，Huang Yonghua，et al.

　　Department of Internal Neurology，Luan County People's Hospital of Tangshan，Tangshan063700.

　　【Abstract】 Objective To explore the pathogenic relationship between glucose carrier protein1(55kDa Glut-1)in blood-brain barrier(BBB)and hypertensive intracerebral hemorrhage(HIH).Methods Human brain tissue samples were obtained at autopsy from15patients with HIH and7age-matched controls.We adopted immunohisto-chemical techniques(Ultra Vision Streptavidin/Peroxidase-plus Kit)and a rabbit anti-human Glut-1polyclonal antiserum was used to investigate55kDa Glut-1immunoreactivity of cerebral microvessel endothelial cells(largely in BBB)in three groups of HIH cases compared with controls，4～18h，24～32h and72h later，according to the duration of inpatient to death.And using MPIAS-500，we calculated their immunostaining cells average grey degree(AGD)and average light density(ALD).Results Our study indicated55kDa Glut-1presented specificly at high concen-trations in the BBB，AGD and ALD were(188.83±4.95)and(0.129±0.014)respectively.In the early acute in-sult periods with HIH，Glut-1were enhanced expression in the BBB surrounding the hemorrhage lesions than that of the controls，significantly at24～32h groups，ADG and ALD were(156.49±10.37)and(0.220±0.042)(P<0.001).And a significant reduction of Glut-1immunolabeling density and microvessel amount，following progress-ing edema and necrosis of the brain tissues surrounding the cerebral hemorrhage lesions at72h later，AGD and ALD were(202.19±7.33)and(0.096±0.016)(P<0.01).Conclusion As one of the immediately gene family of cellular stresses reaction，Glut-1gene enhances rapidly expression in BBB with HIH.The elevation of55kDa Glut-1，one of characterization-related proteins and a research model of the specific gene expression in BBB，could repre-sent an important defence and modulation strategy aims at sustaining supply of glucose from blood to brain and main-taining cerebral energy metabolism homeostasis.

　　Key words glucose carrier protein1 blood-brain barrier hypertensive intracerebral hemorrhage immuno-histochemical method

　　近年来，关于葡萄糖载体(glucose transporter protein Glut)家族在脑和机体各组织中的分布、结构和功能调控以及与一些脑疾病(如Alzheimer病、缺血性脑血管病、脑肿瘤等)的发病关系的研究在国外已经成为热点。Glut在分子水平上调控机体各种组织(特别是脑)的血糖稳态(glucose homeostasis)具有至关重要的作用，是决定脑及周围组织中葡萄糖(Glu)细胞内转运和代谢的最关键的一步。目前，在哺乳类动物中已经发现6种Glut，Glut-1、3、5已确定为哺乳类动物脑中参与Glu转运及代谢的主要Glut [1] 。Glut-1(55kDa)在脑组织中高浓度特异性地表达在血-脑屏障(BBB)的毛细血管内皮细胞中，可作为研究BBB组织特异性基因表达的模型 [2] 。45kDa Glut-1则主要表达在星形胶质细胞(astrocytes，简称星形细胞)中 [3] 。本文对高血压性脑出血(HIH)患者的脑组织中，Glut-1蛋白在BBB内皮细胞表达水平的变化规律及与HIH的发病关系进行了初步研究，以期从本质上阐明在HIH中脑维持Glu稳态与能量代谢的防御反应的病理生理机制。

　　1 临床资料

　　1.1 病例选择及脑组织标本制备 人脑组织标本来源于15例HIH患者，死亡后9～48h的尸检材料。15例HIH患者，男∶女=9∶6，年龄53～79岁，平均(67.73±6.86)岁，生前均经CT或MRI临床确诊并经尸检病理学诊断，原发脑出血病灶位于单侧大脑半球基底节区或丘脑，其中有8例经临床或病理学证实破入脑室，或继发额叶、小脑、脑干出血。根据HIH患者入院到死亡的时间，将其分为3组:4～18h组(5例)、24～32h组(6例)、72h之后组(4例)。7例对照组来自非神经系统疾病死亡的尸检脑组织标本，男∶女=4∶3，年龄57～83岁，平均(70.57±7.96)岁。全部入选病例均无糖尿病史。

　　脑组织取材选择原发出血病灶(基底节区或丘脑)与正常交界区域，对照组相应部位取材。脑组织切块(1cm 3 )经过10%中性福尔马林固定，充分脱水、透明、浸蜡、包埋，包埋过程中石蜡保持在60°C。5μm连续切片，用多聚赖氨酸固定于载玻片。

　　1.2 免疫组化染色方法 兔抗人Glut-1多克隆抗体(AB1341)由美国加州Chemicon国际公司提供，免疫标记染色采用链霉菌抗生物素-过氧化物酶免疫组化染色试剂盒(SP法加强型)，为福州迈新生物技术开发公司产品。常规脱蜡至水化，PBS洗5min×3次，置于0.01mM枸橼酸缓冲液中微波炉抗原修复5min×3次。然后加过氧化物酶阻断液以阻断内源性过氧化物酶的活性，加非免疫性羊血清封闭。标记一抗(PBS稀释1∶2000，1∶1000)于4°C孵育过夜。PBS洗5min×3次，加生物素标记的二抗室温孵育30min，PBS洗5min×3次，再加链霉菌抗生物素-过氧化酶室温作用30min。DAB显色，苏木素复染细胞核。常规脱水透明，中性胶封片、观察。每批染色以PBS液取代一抗做阴性空白对照和对照组脑组织标本阳性对照。为观察反应性星形细胞Glut-1(45kDa)在不同时间组中的表达变化，在相同层面的切片进行GFAP染色标记做对照观察(鼠抗人GFAP单抗为美国加州Maxim生物技术公司的制品，MAB-0081)。

　　1.3 结果判定 脑组织标本中，在微血管内皮细胞和星形细胞的胞膜及胞浆中出现棕色染色者为阳性，并且采用多 媒体彩色病理图文系统(MPIAS-500，同济医科大学清平影像工程公司生产)计算脑微血管内皮细胞中55kDa Glut-1、GFAP标记阳性的星形细胞中45kDa Glut-1染色的平均灰度(average grey degree，AGD)和平均光密度(average light den-sity，ALD)，AGD分为0(黑)～255(白)，ALD为一定灰度值的像素点数，反映组织标本各部分吸收光的强弱程度。

　　1.4 统计学方法 所有计量资料数据用均数±标准差(ˉx±s)表示，两组间比较用成组t检验。

　　2 结果

　　2.1 对照组 在对照组(见图1)脑组织标本(基底节区或丘脑)中，Glut-1高浓度表达在脑微血管内皮细胞，其阳性染色清晰地勾画出了脑微血管及BBB毛细血管内皮细胞的边界，微血管形态完整、流畅，细胞膜及胞浆呈一致的棕黄色染色，细胞核中染色呈阴性。计算55kDa Glut-1在脑微血管内皮细胞表达的AGD和ALD均值分别是188.83±4.95和0.129±0.014。在星形细胞中因为表达量较少(1/3～5视野，10×20)而未达检测水平。

　　2.2 HIH组

　　2.2.1 4～18h组 入院至死亡4～18h的尸检脑组织标本中(见图2)，在出血灶周围区(缺血半暗带)出现大量炎性细胞浸润，微血管充血、管壁水肿。脑微血管内皮细胞的Glut-1蛋白表达水平开始应激性表达增高，其AGD、ALD均值分别是177.48±3.34和0.155±0.011，其中AGD低于对照组6.01%(P<0.01)，ALD高于对照组20.16%(P<0.01)，见表1。

　　表1 HIH4～18h组BBB-Glut-1表达水平的变化 (略)

　　2.2.2 24～32h组 在此时间组脑组织标本中(见图3)，脑微血管内皮细胞的Glut-1表达水平出现戏剧性增高反应而达到最高峰值，脑微血管及毛细血管染色为棕褐色。其AGD、ALD均值分别是156.49±10.37和0.220±0.042，其中AGD显著低于对照组17.12%(P<0.001)，ALD显著高于对照组70.54%(P<0.001)。星形细胞(GFAP标记阳性)开始反应性增生、增殖，Glut-1(45kDa)应激表达可见轻度增加，见表2。

　　表2 HIH24～32h组BBB-Glut-1表达水平的变化 (略)

　　2.2.3 72h之后组 入院至死亡72h～5天的尸检脑组织标本中(见图4)，脑组织广泛高度水肿，出血灶周围神经细胞及微血管内皮细胞水肿、坏死而出现点状出血，大量星形细胞反应性增生、肥大。脑微血管及毛细血管因缺血缺氧而变性、坏死，BBB大量破坏，数量明显减少，形态不规整。Glut-1(55kDa)在脑微血管内皮细胞的表达水平已经明显下降低于对照组，其AGD、ALD均值分别是202.19±7.33和0.096±0.016，AGD高于对照组7.08%(P<0.01)，ALD低于对照组25.89%(P<0.01)，见表3。而在反应性星形细胞中(GFAP标记阳性，见图5)，Glut-1(45kDa)的表达水平在72h后明显增加，其AGD、ALD均值分别是202.19±7.33和0.096±0.016，与此时间组脑微血管内皮细胞中Glut-1的表达水平近似，二者AGD、ALD均值差异无显著性，P>0.05。

　　表3 HIH72h～5天组BBB-Glut-1表达水平的变化 (略)

　　3 讨论

　　在脑的BBB毛细血管内皮细胞中，Glut-1(55kDa)蛋白作为BBB特性相关蛋白之一，在环境应激状态下，如在缺血性脑血管病(ICVD)及Glu缺乏的实验研究中，具有诱导反应性表达增加的特性，被认为属于细胞应激反应有关的即早基因家族 [4] 。Glut-1这种特异基因的表达使机体脑获得了BBB的生化特性，其管腔面、非管腔面、胞浆中的构成比分别是12%、48%、40%。非管腔面是管腔面的4倍(与Glut-1代谢动力学参数Km值的两侧不对称性一致)，而胞浆池中高浓度的Glut-1在机体应激状态下可迅速集聚再分布到细胞膜上 [5] 。这种膜蛋白的分布和功能特性是脑BBB内皮细胞更具有跨上皮细胞转运的特点，在脑神经细胞的微环境中为Glu稳定摄取及代谢提供了一种最佳化的超稳定机制。

　　BBB作为机体维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础，在高血压性脑出血病理进程(特别是脑水肿形成过程)中占有重要地位。近年来，许多动物实验及临床病理研究证实:在脑出血病灶周围的脑组织存在进行性水肿和缺血损伤“半暗带”(ischemic penumbra)，其病理生理机制是局部脑组织压力升高、脑血流量(CBF)减少、BBB破坏与局部渗透性活性物质产生(结果引起血浆蛋白等的外渗)、凝血酶和蛋白酶诱导的炎性反应 [6] 。本实验研究结果表明:HIH患者脑组织中，在发病4～18h出血病灶周围(“缺血半暗带”)，脑微血管内皮细胞中Glut-1蛋白的表达水平开始应激性表达增高，反映了Glut-1即早诱导反应的特性。在24～32h组，Glut-1的表达水平出现戏剧性的增高反应，ALD均值达到最高峰(高于对照组70.54%)，与文献中ICVD的实验研究结果一致(脑缺血缺氧24h后，55kDa Glut-1表达水平高于对照组66%，此时脑组织中Glu浓度与脑/血Glu比率高于对照组30%～45%) [7，8] 。此时间组星形胶质细胞开始反应性增生，45kDa Glut-1蛋白表达轻度增加。在从发病至死亡72h～5天组中，出血病灶周围脑组织重度水肿、缺血、坏死，BBB大量破坏，55kDa Glut-1表达 已经明显减少，ALD均值低于对照组25.89%，而星形细胞大量反应性增生、增殖肥胖，45kDa Glut-1表达明显增加，提示在HIH脑组织缺血、水肿损伤的病理过程中，神经胶质细胞应激反应的机制为神经元提供了保护、修复的功能。

　　在HIH出血病灶周围脑组织中，由于进行性水肿、缺血缺氧，Glu底物缺乏且无氧酵解加速导致高能磷酸盐耗竭，引起一系列的代谢级联反应(如细胞内高Ca 2+ 、细胞外高K + 、兴奋性氨基酸释放等)而最终导致细胞死亡，构成了HIH脑缺血缺氧损害的发病基础。尽管目前的一些证据表明脑对缺血缺氧损伤的细胞反应还很复杂，如应激反应蛋白、细胞因子、生长因子等新的蛋白诱导合成 [9] 。无疑Glut-1蛋白表达水平的增高为充分保障缺血缺氧的脑组织的Glu供应和维持脑的能量代谢稳态提供了一种重要的防御调控机制。有研究发现，BBB-Glut-1基因表达的调节机制发生在基因转录时或mRNA转录后稳定期 [10] ，目前还不清楚:是哪些突触的和(或)激素的因子调控神经细胞Glut基因的表达和脑Glut蛋白系统的功能活动，这将对HIH和ICVD中脑的Glu稳态的破坏以及一系列病理学改变给予进一步本质上的说明。

　　(本文图片见封三)(略)

　　参考文献

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