脑血管病患者血浆同型半胱氨酸水平及MTHFR基因多态性分析

　　作者：蔡一敏 林琳 周维智 陆青　　作者单位： 200060 上海市普陀区人民医院神经内科

　　【摘要】 目的 探讨血浆同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平与脑血管病的关系及其水平升高的遗传和营养因素。方法 对130例脑梗死和77例脑出血患者及65例正常对照者采用高效液相色谱(HPLC)法检测血浆Hcy水平、放射免疫法测定叶酸、VitB12水平，运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)分析亚甲基四氢叶酸还原酶methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因多态性，并加以对照分析。结果 脑梗死组、脑出血组血浆Hcy水平分别为(19.87±11.67)μmol/L、(20.15±10.12)μmol/L均显著高于对照组(11.41±3.28)μmol/L(P<0.01);而脑梗死组与脑出血组间差异无显著性(P>0.05)。MTHFR有3种基因型，脑梗死组、脑出血组和对照组C/C型基因频率分别为(0.39、0.46、0.53)，C/T型分别为(0.35、0.31、0.30)，T/T型分别为(0.26、0.23、0.17)，T等位基因频率分别为(0.43、0.39、0.32)，各基因型及等位基因频率差异无显著性(P>0.05)。各组中T/T基因型血浆Hcy水平与C/C型比较差异有非常显著性(P<0.01)，而病例组中C/T型血浆Hcy水平与C/C型相比亦差异有非常显著性(P<0.01)。脑梗死组与脑出血组叶酸、VitB12水平显著低于正常对照组(P<0.01)。结论 血浆Hcy水平升高是脑血管病的主要危险因素。MTHFR基因677位点碱基C→T突变可能是血浆Hcy水平升高的主要影响因素，但与脑血管病的直接关系有待进一步研究，而叶酸VitB12与Hcy水平也有关联。

　　关键词 同型半胱氨酸 亚甲基四氢叶酸还原酶 脑血管病 基因多态性

　　Correlation analysis between plasma homocysteine level and the gene polymorphism of MTHFR in cerebrovascular disease patients

　　Cai Yimin,Lin Lin,Zhou Weizhi,et al.

　　Department of Neurology,Shanghai Putuo District People’s Hospital,Shanghai 200060.

　　【Abstract】 Objective To investigate the relationship of plasma homocysteine homocysteine level with cerebrovascular disease and the genetic & nutritional factors of elevated plasma Hcy level.Methods 130 patients with cerebral infarction,77 patients with cerebral bleeding and 65 healthy controls were recruited in the study.Their plasma total Hcy levels were measured by high-performance liquid chromatography(HPLC)method,the level of folate & VitB12 was measured by using radioimmuoassay and MTHFR genotype was measure by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Results The plasma Hcy level in cerebral infarction patients[(19.87±11.67) μmol/L] and cerebral bleeding patients[(20.15±10.12) μmol/L] were both markedly higher than that of the controls[(11.41±3.28) μmol/L](P<0.01);however,there were no significant difference between them(P>0.05).There were 3 kinds of genotypes.The frequencies of c/c genotype in cerebral infarction patients,cerebral bleeding patients and the controls were(0.39,0.46,0.53)respectively,C/T genotype were(0.35,0.31,0.30),T/T genotype were(0.26,0.23,0.17),frequencies of T allele were(0.43,0.39,0.32).Neither the genotype nor the allele frequency was importantly different between patients and control subjects.The plasma Hcy levels were the higest in each group with T/T genotype.Furthermore,the Hcy level elevated could also be seen in two disease groups with C/T genotype.The folate and VitB12 levels of patients were obviously lower than that of control group.Conclusion The higher plasma Hcy level might be

　　a main risk factor for cerebrovascular disease and is related to the CT mutation at lacus 677 of MTHFR gene and folate level.However,it should be further studied the direct relationship between MTHFR gene and cerebravascular disease.

　　Key words homocysteine methylenetetrahydrofolate reductase cerebrovascular disease gene polymorphism

　　自1969年McCully首次发现血浆同型半胱氨酸水平升高与动脉血栓形成有关以来，近三十余年经各项研究已证实，体内高同型半胱氨酸血症是脑血管病独立危险因素[1]。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种含硫氨基酸，由日常饮食中蛋氨酸去甲基化生成S腺苷蛋氨酸后酶水解反应的产物，其代谢途径主要为经过再甲基化途径即Hcy在蛋氨酸合成酶催化下(叶酸倚赖酶)以VitB12为辅酶再甲基化生成蛋氨酸，这一反应须由5N，10N亚甲基四氢叶酸经亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)催化产生的5N甲基四氢叶酸提供甲基来完成。因此目前认为引起Hcy升高的原因有代谢酶(MTHFR)基因突变和营养因素二方面。为此我科从2003年2月～2004年5月对207例住院的首次急性脑血管病患者进行了血浆tHcy、叶酸、VitB12浓度测定及MTHFR基因多态性分析，旨在从分子水平探讨脑血管病的发病机制及可能的干预手段。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 病例选择：所有病例均为我院神经内科2003年2月～2004年5月住院的急性脑血管病患者，诊断依据1995年全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准及评分方法[2]，并均经头颅CT和(或)MRI证实，除外脑栓塞和严重心肝肾功能障碍者。入选病例共207例，其中男107例，女100例，年龄38～89岁，平均(65.19±11.88)岁。病例分组：入选病例分为脑出血组77例，其中男44例，女33例，年龄42～85岁，平均(65.69±11.62)岁;脑梗死组130例，其中男63例，女67例，年龄38～89岁，平均(64.9±12.06)岁。各组在年龄、性别、民族、吸烟及传统危险因素(如血糖、高血压、血脂等)方面均差异无显著性。

　　正常对照组：65例，其中男33例，女32例，年龄35～82岁，平均(62.25±12.09)岁，均经体检无心脑血管疾病及其他系统疾病者。

　　以上各组均正常饮食,排除可能影响Hcy的药物服用史(甲氨蝶呤、抗癫痫药物、维生素等)。

　　1.2 研究方法 所有研究对象均在清晨空腹抽取静脉血进行测定：(1)血浆Hcy浓度测定：应用DS30同型半胱氨酸专用检测仪(英国Drew Sientific公司提供)，采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆总Hcy浓度(tHcy);(2)叶酸VitB12浓度测定：采用放射免疫法检测;(3)MTHFR基因型分析：采用300μl 100%异丙醇提取DNA并用70%的乙醇清洗干燥后加入100μl的DNA水解液将DNA水解后储存于2℃～8℃备用，用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)方法分析MTHFR基因型,按参考文献[3]设计MTHFR基因的扩增引物。MTHFR C677T引物序列如下：P1;5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’，P2：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’。PCR产物采用2%国产琼脂糖凝胶电泳检查，扩增片段长度为198bp，扩增产物加入限制性内切酶Hinf I，酶切产物经3%进口琼脂糖凝胶电泳，PCR紫外透射仪下观察分析结果。

　　1.3 统计学方法 各项检测结果计量值用均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，然后两两比较;计数资料采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 血浆tHcy及叶酸、VitB12浓度测定 结果显示脑梗死组、脑出血组的血浆Hcy水平较对照组有显著升高，叶酸、VitB12则较对照组下降;而脑梗死组与脑出血组之间血浆Hcy、叶酸、VitB12水平差异无显著性，见表1。

　　2.2 脑梗死组、脑出血组及对照组MTHFR基因型频率 符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。各组基因型及等位基因分布见表2。3组基因型分布差异无显著性(χ2=4.06，P>0.05),等位基因频率3组比较亦差异无显著性(χ2=2.58，P>0.05)。

　　2.3 各组3种MTHFR基因型与血浆Hcy水平的关系 见表3。

　　表1 血浆tHcy、叶酸、VitB12浓度测定结果 (略)

　　注：*脑梗死组、脑出血组分别与正常对照组比较;▲脑梗死组与脑出血组比较，t=0.18，P>0.05

　　表2 MTHFR基因C677T基因型及等位基因频率(略)

　　表3 MTHFR基因型与血浆Hcy水平的关系(略)

　　注：各组内*C/C型与C/T型比较;**C/C型与T/T型的比较;***C/T型与T/T型比较。

　　3 讨论

　　1984年Brattstorm首次报道了高Hcy血症与脑血管病关系，他们观察了19例动脉粥样硬化性脑血管病患者发现蛋氨酸负荷后血浆Hcy水平明显高于对照组，以后多项研究表明血浆Hcy水平升高和脑卒中间存在密切联系。笔者此次的研究同样证明脑血管病组无论是脑梗死组还是脑出血组其血浆Hcy水平均高于对照组，有统计学意义(P<0.01)，而脑梗死组与脑出血组之间差异无显著性(P>0.05)。这与Malinow等[4]的报道相同，这可能与二者的病理生理基础有关即Hcy升高最终是通过动脉粥样硬化而致病的。虽然目前对Hcy的致病机制尚不完全清楚，但主要是通过直接损伤血管和凝血系统受损二方面起作用[5]：血浆Hcy升高促使氧自由基形成，引起血管内皮细胞损伤，并促进动脉平滑肌增生，同型半胱氨酸巯基内酯与低密度脂蛋白结合形成集合体，再由内膜吞噬形成泡沫细胞，构成新生的动脉粥样硬化斑块;另一方面Hcy加强凝血因子Ⅴ的活性，抑制蛋白C的活性，阻止tPA与内皮细胞结合，促进血栓形成。另外内皮损伤而致血小板活化，聚集增加，PGI2-TXA2失衡，并通过刺激NMDA受体对神经系统产生毒性[6]，继而引发一系列瀑布现象。

　　1994年Goyette等[7]首次成功将人MTHFR的cDNA定位于常染色体1p36.3上，1995年后Frosst等[3]证实MTHFR基因在677位点上的突变最常见，碱基C被T取代使编码的丙氨酸被缬氨酸替代，造成MTHFR活性下降，研究发现[8]突变纯合子(TT型)酶活性只有正常的30%。杂合子(CT型)酶活性位只有正常的65%，导致纯合子血浆Hcy水平较杂合子和野生型(CC型)明显升高。从本研究3种基因型与血浆Hcy水平观察，脑梗死组与脑出血组的CC型Hcy浓度与CT型TT型比较差异有显著性，后两种突变基因的Hcy浓度显著升高。正常对照组中TT型Hcy浓度较CC型CT型同样有显著升高，说明TT型MTHFR基因突变可能是引起高Hcy血症的重要遗传因素，但在病例组中TT型与CT型的Hcy浓度却差异无显著性。笔者推测，可能与病例组中叶酸以及VitB12水平较正常对照组低，加重了杂合子活性的降低有关。叶酸及VitB12是Hcy代谢过程中重要的辅酶，目前有认为MTHFR基因突变在叶酸水平较低时对Hcy水平的影响较大[3]，而大量研究已初步证实高Hcy血症可通过补充叶酸及VitB12而降低[9]。从3组叶酸测定结果来看，两病例组患者叶酸均显著低于正常对照组，进一步提示营养因素缺乏是造成高Hcy血症的另一重要原因。

　　但目前关于MTFHR基因多态性是否为脑血管病的直接危险因素尚存争议。有学者认为TT型基因突变与Hcy升高有关而与脑血管病无关[10]。本研究结果表明脑梗死组和脑出血组与正常对照组中均存在3种基因型(CC型、CT型、TT型)，其中脑梗死组T等位基因频率略有升高，但经统计学比较，在3种基因型及C、T等位基因频率的分布均差异无显著性，而另一些学者则持相反观点。我们认为这与人群的选择、年龄、营养状况均有关，另外可能与Hcy另一条代谢通路转硫化途径中CBS基因变异有关。这有待进一步研究。

　　无论何种因素引起Hcy升高，目前已有大规模的前瞻性随机对照试验表明[11]，逆转高Hcy血症治疗可使心脑血管发病率以及病死率降低。作为临床工作者在目前应用基因手段干预尚不成熟的时候，通过将Hcy测定作为象血糖血脂一样的常规检测项目，并应用简单经济的药物――叶酸、B族维生素治疗，做到早期发现、早期纠正高Hcy血症，可能会成为防治脑血管病的一个重要途径。

　　参考文献

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　　2 中华神经科学会，中华神经外科学会.各类脑血管疾病诊断要点.中华神经科杂志，1996,29(6):379-380.

　　3 Frosst P,Blam HJ,Milos R,et al.A candidate genetic risk factor for vascular disease:a common mutation in Methylenetetrahydrofolate reductase.Nat Genet,1995,10:111-113.

　　4 Malinow MR.Hyper homocystetinemia:a common and easily reversible risk factor for occlusive atherosclemosis.Circulation,1990,81:2004-2006.

　　5 Welch GN,Loscalzo J.Homocysteine and atherothrombosis.N Engl J Med,1998,388:1042-1050.

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　　7 Goyette P,Summer JS,Milos R,et al.Human methylenetetrahydrofolate reductase:Isolation of cDNA,mapping and mutation identification.Nature Genet,1994,7:195-200.

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　　10 Markus HS,Ali N,Swaminathan R,et al.A common polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene,homocysteine,and ischemic cerebrovascular disease.Stroke,1997,28:1739-1743.

　　11 Van-der-Griend R,Biema DH,Banga JD.Hyper homocysteinaemia as a cardiovascular risk factor:an update.Stroke，2000,31(8):1889-1892.