骨桥蛋白在胰腺癌中的表达及其意义

　　作者：李西梅,杨少奇,黄李雅　　作者单位：宁夏医科大学附属医院消化科，银川

　　【摘要】 目的 探讨骨桥蛋白(OPN)在胰腺癌组织中表达的临床意义。方法 应用免疫组织化学(S-P)方法检测OPN在50例胰腺癌、30例癌旁组织中的表达，并分析其与胰腺癌临床病理特征的关系。结果 50例胰腺癌标本中32例OPN表达阳性，阳性表达率为64.0%，30例胰腺癌旁组织中6例OPN表达阳性，阳性表达率为20.0% ，OPN在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。OPN的表达与肿瘤的分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，与肿瘤直径、性别和年龄无明显关系。结论 OPN在胰腺癌中呈高表达，其表达与胰腺癌侵袭转移密切相关。

　　【关键词】 骨桥蛋白; 胰腺癌; 免疫组织化学

　　Expression and Clinical Significance of Osteopontin in Patients with Pancreatic Cancer　Dept. of Gastroenterology， the Affiliated Hosp. of Ningxia Med. Univ.，Yinchuan 750004　Abstract：Objective To explore the expression and clinical significance of osteopontin (OPN) in patients with pancreatic cancer. Methods OPN was measured by immunohistochemical SP method in 50 cases with Pancreatic cancer and 30 cases of tumor-adjacent. Results OPN was expressed in 32 of 50 Pancreatic cancer tissues and 6 of 30 tumor-adjacent tissues. The positive rate of OPN in Pancreatic cancer tissue and the adjacent tissue was 64.0%and 20.0% respectively .The positive rate of OPN expression in Pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in tumor-adjacent tissues (P<0.05). OPN expression was significantly related with tumor differentiation，lymph node metastases and TNM stage.(P<0.05). The tumor primary diameter， gender and age were not associated with the positive rate of OPN. Conclusion OPN is highly expressed in Pancreatic cancer tissues， and the expression is closely related to the invasion and metastases of pancreatic cancer.

　　Key words：osteopontin; pancreatic cancer; immunohistochemistry

　　近年来国内外胰腺癌的发病率均呈上升趋势，胰腺癌作为恶性度极高的消化系统肿瘤，其5年生存率低于5%，预后差的原因主要与肿瘤浸润性生长和早期转移有关[1]。近来研究认为，骨桥蛋白(osteopontin ，OPN)是一种转移相关的分泌性糖基化磷蛋白，与胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等人体多种肿瘤的转化、侵袭、转移过程关系密切[2]。OPN是否参与胰腺癌的侵袭转移，目前尚无定论。本研究采用免疫组化SP法检测OPN在胰腺癌组织中的表达及分布状况，初步探讨其与胰腺癌临床病理特征和转移的关系。

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料

　　胰腺癌组织取材自宁夏医科大学附属医院2001年1月-2008年4月保存完整的蜡块标本共80例，男42例，女38例，平均年龄54.4岁。经病理诊断证实，非癌胰腺组织(胰腺癌旁组织)30例，胰腺癌病例50例， 所有标本均为导管腺癌， 病理类型包括高分化腺癌17例、中分化腺癌13例和低分化腺癌20例。其中无淋巴结转移26例，有淋巴结转移24例。所有病例均无其它严重内科疾病或其它恶性肿瘤，术前均未接受放疗或化疗。TNM分期参照国际胰腺癌TNM分期标准(UICC，1997)进行。

　　1. 2 方法

　　OPN的检测采用免疫组化SP法。组织切片常规脱蜡水化后行柠檬酸盐高温高压抗原修复。3%双氧水封闭内源性过氧化物酶10min， PBS漂洗后每张切片滴加50μL正常非免疫羊血清室温下孵育10min，加兔抗人OPN多克隆抗体，37℃孵育2h，PBS漂洗。滴加生物素标记的羊抗兔IgG，37℃孵育10min，PBS漂洗。加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶复合物，37℃孵育10 min，PBS漂洗。DAB显色5～10min，PBS终止反应。苏木素复染，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察结果。正常非免疫羊血清及PBS代替一抗作阴性对照，用胃癌组织的OPN阳性切片作阳性对照。主要试剂兔抗人骨桥蛋白多克隆抗体(浓缩型，工作液浓度为1∶100)及SP试剂盒均购自福州迈新生物工程有限公司。

　　1.3 结果判断

　　DAB显色后阳性表达呈棕黄色颗粒沉着。根据着色强度和阳性细胞百分比进行评分。细胞膜及细胞浆中见清晰棕黄色颗粒为OPN阳性表达细胞。每例切片选5个高倍视野，按阳性细胞数占同类细胞的百分比，将免疫组化结果分为:阴性(-)，<5%;弱阳性(+)，5%～25%;中度阳性(++)，25%～50%;强阳性(+++～++++)，>50%。

　　1.4 统计学方法

　　用SPSS12.0软件进行χ2检验， P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1 OPN在胰腺癌及癌旁组织中的表达情况

　　OPN主要在胞质表达，异型明显的细胞胞浆中也有表达。50例胰腺癌标本中32例OPN表达阳性，阳性表达率为64.0%，30例胰腺癌旁组织中6例OPN表达阳性，阳性表达率为20.0%。胰腺癌中OPN阳性率高于癌旁组织(χ2=14.56 ，P<0.01)，图1、2，见封4。

　　2.2 癌组织中OPN表达与肿瘤临床特征病理学特征之间的关系

　　胰腺癌中OPN的表达与肿瘤分化程度呈负相关，与TNM分期、淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，即低分化，TNM分期偏高(属于III～Ⅳ期)，存在淋巴结转移的病例OPN表达阳性率相对较高。而OPN的表达与肿瘤直径、性别及年龄无明显关系(见表1)。表1 胰腺癌组织中OPN表达与临床病理特征之间的关系(略)

　　3 讨论

　　骨桥蛋白是一种富含丝氨酸残基的分泌性磷酸化糖蛋白，有一个由天冬氨酸残基构成的N端信号序列及通过β片层从侧面所识别的甘-精-甘-天冬-丝氨酸 (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，GRGDS) 细胞黏附序列即RGD 序列，并含有多个功能结合区，如钙结合域、凝血酶裂解位点及整合素RGD结合序列[3]。OPN广泛存在于人的尿液、血液以及胃肠道、胰腺、肺等组织中，在细胞的黏附与迁移、组织修复、细胞的信号转导中具有重要作用。随着肿瘤研究的不断深入，目前研究[1，4]认为OPN参与人体多种肿瘤的转化、侵袭、转移过程，它在一定程度上能够反映肿瘤的恶性程度。OPN可能是一个很好的肿瘤转移标志物及监测肿瘤预后的指标。

　　Denhardt等[4]认为，无论是肿瘤细胞还是基质细胞，它们产生的OPN都能提高肿瘤细胞的转移能力， 无论是细胞、动物实验还是临床实体肿瘤研究，均发现OPN与肿瘤转移的关系十分密切。

　　本研究结果显示，OPN在胰腺癌组织中呈高表达， 其表达阳性率明显高于癌旁组织，提示OPN可能在胰腺癌的发生发展中起重要作用。本研究OPN的表达与胰腺癌分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关，而与肿瘤直径、性别及年龄无明显关系，此结果与国内外文献[5-6]报道较一致。关于OPN参与胰腺癌侵袭转移的机制目前尚不明确。

　　Angelucci 等发现[7]当OPN的RGD序列被其受体整合素αvβ3识别或与CD44突变体结合后，可通过促进肿瘤细胞的黏附、细胞外基质的降解，抑制细胞凋亡等途径参与肿瘤的浸润和转移。杨力等[8]在胃癌中的研究表明，OPN可能通过激活NF-KB信号转导通路，使转移相关分子的转录活性增强，引起这些分子表达的增多，导致癌细胞的侵袭、转移。而目前对于胰腺癌中OPN参与的信号通路及其参与的调节因子等诸多细节尚不清楚。

　　总之，胰腺癌中OPN的表达与其侵袭转移等恶性行为相关，所以骨桥蛋白的检测对于胰腺癌患者临床治疗方法的选择及预后的评估具有一定意义。

　　【参考文献】

　　[1]Koopermann J，Fedarko NS，Jain A，et al.Evaluation of osteopontin as biomarker for pancreatic adenocarcinoma[J].　Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13(3):487-491.

　　[2]Coppola D，Szabo M，Boulware D，et al.Correlation of osteopontin protein expression and pathoogical stage across a wide variety of tumor histologies[J]. Clin Cancer Res，2004，10(1):184-190.

　　[3]Weber GF. The metastasis gene osteopontin: a candidate target for cancertherapy[J]. Biochimica te Biophysica Acta， 2001，1552:61-85.

　　[4]Denhardt DT，Mistretta D，Chambers AF，et al.Transcriptional regulation of osteopontin and the metastatic phenotype: evidence for a Rasactivated enhancer in the human OPN promoter[J].Clin Exp Metastasis，2003，20(1):77.

　　[5]王维新，张国新，都波，等.骨桥蛋白、CD44v6在胰腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系[J].南京医科大学学报(自然科学版)，2007，27(8)：801-803.

　　[6]Sedivy R，Peters K，Kloppel G. Osteopontin expression in ductal adenocarcinomas and undifferentiated carcinomas of the pancreas[J].Virchows Arch， 2005，446(1):41-45.

　　[7]Angelucci A，Festuccia C，Gravina GL，et al. osteopontin enhances the cell proliferation induced by the epidermal growth factor in human Prostate cancer cells [J].Prostate，2004，59(2):157.

　　[8]杨力，张东涛，郭新宁.骨桥蛋白和核因子-KB在侵袭转移性胃癌中的表达[J].中国肿瘤临床，2004，31(16):901-903.

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　　学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。

　　骨桥蛋白在胰腺癌中的表达及其意义

　　作者：李西梅，杨少奇，黄李雅，阮继刚，杨力 作者单位：宁夏医科大学附属医院消化科，银川 750004

　　【摘要】 ：目的 探讨骨桥蛋白(OPN)在胰腺癌组织中表达的临床意义。方法 应用免疫组织化学(S-P)方法检测OPN在50例胰腺癌、30例癌旁组织中的表达，并分析其与胰腺癌临床病理特征的关系。结果 50例胰腺癌标本中32例OPN表达阳性，阳性表达率为64.0%，30例胰腺癌旁组织中6例OPN表达阳性，阳性表达率为20.0% ，OPN在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。OPN的表达与肿瘤的分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，与肿瘤直径、性别和年龄无明显关系。结论 OPN在胰腺癌中呈高表达，其表达与胰腺癌侵袭转移密切相关。

　　【关键词】 骨桥蛋白; 胰腺癌; 免疫组织化学

　　Expression and Clinical Significance of Osteopontin in Patients with Pancreatic Cancer　Dept. of Gastroenterology， the Affiliated Hosp. of Ningxia Med. Univ.，Yinchuan 750004　Abstract：Objective To explore the expression and clinical significance of osteopontin (OPN) in patients with pancreatic cancer. Methods OPN was measured by immunohistochemical SP method in 50 cases with Pancreatic cancer and 30 cases of tumor-adjacent. Results OPN was expressed in 32 of 50 Pancreatic cancer tissues and 6 of 30 tumor-adjacent tissues. The positive rate of OPN in Pancreatic cancer tissue and the adjacent tissue was 64.0%and 20.0% respectively .The positive rate of OPN expression in Pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in tumor-adjacent tissues (P<0.05). OPN expression was significantly related with tumor differentiation，lymph node metastases and TNM stage.(P<0.05). The tumor primary diameter， gender and age were not associated with the positive rate of OPN. Conclusion OPN is highly expressed in Pancreatic cancer tissues， and the expression is closely related to the invasion and metastases of pancreatic cancer.

　　Key words：osteopontin; pancreatic cancer; immunohistochemistry

　　近年来国内外胰腺癌的发病率均呈上升趋势，胰腺癌作为恶性度极高的消化系统肿瘤，其5年生存率低于5%，预后差的原因主要与肿瘤浸润性生长和早期转移有关[1]。近来研究认为，骨桥蛋白(osteopontin ，OPN)是一种转移相关的分泌性糖基化磷蛋白，与胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等人体多种肿瘤的转化、侵袭、转移过程关系密切[2]。OPN是否参与胰腺癌的侵袭转移，目前尚无定论。本研究采用免疫组化SP法检测OPN在胰腺癌组织中的表达及分布状况，初步探讨其与胰腺癌临床病理特征和转移的关系。

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料

　　胰腺癌组织取材自宁夏医科大学附属医院2001年1月-2008年4月保存完整的蜡块标本共80例，男42例，女38例，平均年龄54.4岁。经病理诊断证实，非癌胰腺组织(胰腺癌旁组织)30例，胰腺癌病例50例， 所有标本均为导管腺癌， 病理类型包括高分化腺癌17例、中分化腺癌13例和低分化腺癌20例。其中无淋巴结转移26例，有淋巴结转移24例。所有病例均无其它严重内科疾病或其它恶性肿瘤，术前均未接受放疗或化疗。TNM分期参照国际胰腺癌TNM分期标准(UICC，1997)进行。

　　1. 2 方法

　　OPN的检测采用免疫组化SP法。组织切片常规脱蜡水化后行柠檬酸盐高温高压抗原修复。3%双氧水封闭内源性过氧化物酶10min， PBS漂洗后每张切片滴加50μL正常非免疫羊血清室温下孵育10min，加兔抗人OPN多克隆抗体，37℃孵育2h，PBS漂洗。滴加生物素标记的羊抗兔IgG，37℃孵育10min，PBS漂洗。加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶复合物，37℃孵育10 min，PBS漂洗。DAB显色5～10min，PBS终止反应。苏木素复染，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察结果。正常非免疫羊血清及PBS代替一抗作阴性对照，用胃癌组织的OPN阳性切片作阳性对照。主要试剂兔抗人骨桥蛋白多克隆抗体(浓缩型，工作液浓度为1∶100)及SP试剂盒均购自福州迈新生物工程有限公司。

　　1.3 结果判断

　　DAB显色后阳性表达呈棕黄色颗粒沉着。根据着色强度和阳性细胞百分比进行评分。细胞膜及细胞浆中见清晰棕黄色颗粒为OPN阳性表达细胞。每例切片选5个高倍视野，按阳性细胞数占同类细胞的百分比，将免疫组化结果分为:阴性(-)，<5%;弱阳性(+)，5%～25%;中度阳性(++)，25%～50%;强阳性(+++～++++)，>50%。

　　1.4 统计学方法

　　用SPSS12.0软件进行χ2检验， P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1 OPN在胰腺癌及癌旁组织中的表达情况

　　OPN主要在胞质表达，异型明显的细胞胞浆中也有表达。50例胰腺癌标本中32例OPN表达阳性，阳性表达率为64.0%，30例胰腺癌旁组织中6例OPN表达阳性，阳性表达率为20.0%。胰腺癌中OPN阳性率高于癌旁组织(χ2=14.56 ，P<0.01)，图1、2，见封4。

　　2.2 癌组织中OPN表达与肿瘤临床特征病理学特征之间的关系

　　胰腺癌中OPN的表达与肿瘤分化程度呈负相关，与TNM分期、淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，即低分化，TNM分期偏高(属于III～Ⅳ期)，存在淋巴结转移的病例OPN表达阳性率相对较高。而OPN的表达与肿瘤直径、性别及年龄无明显关系(见表1)。表1 胰腺癌组织中OPN表达与临床病理特征之间的关系(略)

　　3 讨论

　　骨桥蛋白是一种富含丝氨酸残基的分泌性磷酸化糖蛋白，有一个由天冬氨酸残基构成的N端信号序列及通过β片层从侧面所识别的甘-精-甘-天冬-丝氨酸 (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，GRGDS) 细胞黏附序列即RGD 序列，并含有多个功能结合区，如钙结合域、凝血酶裂解位点及整合素RGD结合序列[3]。OPN广泛存在于人的尿液、血液以及胃肠道、胰腺、肺等组织中，在细胞的黏附与迁移、组织修复、细胞的信号转导中具有重要作用。随着肿瘤研究的不断深入，目前研究[1，4]认为OPN参与人体多种肿瘤的转化、侵袭、转移过程，它在一定程度上能够反映肿瘤的恶性程度。OPN可能是一个很好的肿瘤转移标志物及监测肿瘤预后的指标。

　　Denhardt等[4]认为，无论是肿瘤细胞还是基质细胞，它们产生的OPN都能提高肿瘤细胞的转移能力， 无论是细胞、动物实验还是临床实体肿瘤研究，均发现OPN与肿瘤转移的关系十分密切。

　　本研究结果显示，OPN在胰腺癌组织中呈高表达， 其表达阳性率明显高于癌旁组织，提示OPN可能在胰腺癌的发生发展中起重要作用。本研究OPN的表达与胰腺癌分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关，而与肿瘤直径、性别及年龄无明显关系，此结果与国内外文献[5-6]报道较一致。关于OPN参与胰腺癌侵袭转移的机制目前尚不明确。

　　Angelucci 等发现[7]当OPN的RGD序列被其受体整合素αvβ3识别或与CD44突变体结合后，可通过促进肿瘤细胞的黏附、细胞外基质的降解，抑制细胞凋亡等途径参与肿瘤的浸润和转移。杨力等[8]在胃癌中的研究表明，OPN可能通过激活NF-KB信号转导通路，使转移相关分子的转录活性增强，引起这些分子表达的增多，导致癌细胞的侵袭、转移。而目前对于胰腺癌中OPN参与的信号通路及其参与的调节因子等诸多细节尚不清楚。

　　总之，胰腺癌中OPN的表达与其侵袭转移等恶性行为相关，所以骨桥蛋白的检测对于胰腺癌患者临床治疗方法的选择及预后的评估具有一定意义。

　　【参考文献】

　　[1]Koopermann J，Fedarko NS，Jain A，et al.Evaluation of osteopontin as biomarker for pancreatic adenocarcinoma[J].　Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13(3):487-491.

　　[2]Coppola D，Szabo M，Boulware D，et al.Correlation of osteopontin protein expression and pathoogical stage across a wide variety of tumor histologies[J]. Clin Cancer Res，2004，10(1):184-190.

　　[3]Weber GF. The metastasis gene osteopontin: a candidate target for cancertherapy[J]. Biochimica te Biophysica Acta， 2001，1552:61-85.

　　[4]Denhardt DT，Mistretta D，Chambers AF，et al.Transcriptional regulation of osteopontin and the metastatic phenotype: evidence for a Rasactivated enhancer in the human OPN promoter[J].Clin Exp Metastasis，2003，20(1):77.

　　[5]王维新，张国新，都波，等.骨桥蛋白、CD44v6在胰腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系[J].南京医科大学学报(自然科学版)，2007，27(8)：801-803.

　　[6]Sedivy R，Peters K，Kloppel G. Osteopontin expression in ductal adenocarcinomas and undifferentiated carcinomas of the pancreas[J].Virchows Arch， 2005，446(1):41-45.

　　[7]Angelucci A，Festuccia C，Gravina GL，et al. osteopontin enhances the cell proliferation induced by the epidermal growth factor in human Prostate cancer cells [J].Prostate，2004，59(2):157.

　　[8]杨力，张东涛，郭新宁.骨桥蛋白和核因子-KB在侵袭转移性胃癌中的表达[J].中国肿瘤临床，2004，31(16):901-903.